DsRNA reproductible Microinjection et bioessais sur la ponte chez les moustiques et les mouches domestiques

1. insecte préparation Anesthésier les moustiques en eux au froid à 4 ° C pendant plusieurs heures ou en cas d’exposition au CO2 2 min puis maintenant à 4 ° C avant les injections. Froide anesthésier mouches à 4 ° C 2\u20123 h avant les injections. S’assurer que les moustiques et les mouches sont accouplés si la ponte est une variable de réponse.Remarque : La méthode d’anesthetization de moustique dépend de l’espèce et la souche, par exemple, Culex récupérer beaucoup plus vite du froide anesthetization que Aedes aegypti et CO2 knockdown est donc préférable. Sur la glace, soigneusement les moustiques stade ou mouches à l’aide de pinces souples aux pour mettre sur le ventre exposés sur microscope slides ~0.5 cm de distance. Lames standards peuvent contenir deux rangées de 6 moustiques chaque ou mouches de la maison 6 – 7. Laissez un espace de 1 à 1,5 cm à l’extrémité gauche ou droite de la diapositive claire de moustiques et les mouches pour faciliter la manipulation de diapositive. Garder les diapositives d’insectes mis en scène à 4 ° C dans grandes boîtes de Pétri jusqu’au moment de l’injection.Remarque : Percer un trou dans le couvercle de la boîte de Pétri aidera à empêcher les insectes d’être dérangé par déplacement d’air lors de la limitation. Mise des diapositives sur un couple de capillaires en verre fixée sur le fond du plat facilitera la suppression de la boîte de Pétri. 2. insecte Injection Préparer des ARNdb tel que décrit par Estep et al. 5 et Sanscrainte et al. 9. si exempt de contaminants, dsRNA peut être quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance à 260 nm et calcul concentration d’ARN en μg/mL comme un facteur central des dilution260 × 40. Mettre en place dissection microscope et microinjector au-dessus d’une table de refroidissement éolien ou peu profond seau à glace pour effectuer des injections sur le froid anesthésiés moustiques et des mouches (voir étape 1.1-1.3 et Figure 1). Tirez des capillaires en verre d’une pointe fine avec extracteur de l’aiguille (paramètres : chauffage = 15 unités, solénoïde = 4 A).Remarque : Consultez la Table des matières pour plus d’informations du fabricant. Placez l’aiguille capillaire dans un microinjector selon les instructions du fabricant et la pointe aiguille pause en pinçant avec une paire de pinces pour produire une pointe acérée.Remarque : Taille suggérée de l’aiguille est ~ 150 µm pour les moustiques et ~ 250 µm pour la mouche domestique. La valeur microinjector pour le volume de livraison souhaitée. Ménisque mouvement d’aliquotes nL ~ 50 est recommandé pour des microinjections de moustique et facilement observables. Le cas échéant, activez les paramètres de l’injection rapide. Rincer l’aiguille en remplissant et en expulsant l’eau exempte de nucléase 3 fois. Préparer des solutions pour injection à une concentration telle que 100\u2012150 nL fournira la dose souhaitée pour les moustiques et 500 nL volonté fournir désiré dose pour les mouches domestiques.NOTE : A suggéré des doses initiales : 1 µg pour chaque moustique et 5 µg pour chaque mouche5,9. Éventuellement pour les moustiques, ajouter Rhodamine B (pour aider à la visualisation) aux solutions à une concentration finale de 3,0 µg/mL.Remarque : Le colorant sera clairement visible par sa couleur rose après injection à travers la cuticule presque claire sur le ventre à l’intersection de l’abdomen/thorax. Distribuer 3 – 4 µL de solution d’injecter sur une surface propre (par exemple, un morceau de pellicule de paraffine) et amener l’aiguille de verre sans aspirer tout l’air. Enfoncez le bouton d’inject à plusieurs reprises jusqu’à ce que le liquide commence à distribuer de l’aiguille et effacer doucement gouttes avec un chiffon de tâche délicate.Remarque : Bien que certains modèles de microinjectors doivent remblayer la seringue, l’injecteur référencée dans la Table des matières ne fonctionne pas. À l’aide d’un marqueur pointe ultra fine, dessiner dièses ~ 1 mm apart à partir le ménisque du liquid sur le manche de l’aiguille. Cela aidera à visualiser le mouvement du ménisque et veiller à ce que la solution est entré dans le moustique pendant l’injection. Réglez la glissière de moustiques et les mouches (tel qu’établi dans les étapes 1,2-1,3) sous l’aiguille sur le refroidissement éolien de table ou de la glace (Figure 1). S’assurer que ce champ de vue au microscope est assez large pour voir le ménisque de solution dans l’aiguille. Pour les moustiques, alignez l’aiguille avec le tiers moyen de la mesokatepisternum (Figure 2 a) et tandis que contreventement le moustique contre l’aiguille avec une pince placée du côté opposé, doucement perforer la cuticule avec la pointe d’aiguille à l’aide du micromètre de microinjector. Pour les mouches domestiques, alignez l’aiguille avec la mesopleuron (Figure 2 b) et tout en renfort à la volée contre l’aiguille, doucement perforer la cuticule avec la pointe de l’aiguille. Doucement glisser l’aiguille dans le moustique ou voler le corps jusqu’à ce que la pointe a traversé la ligne médiane.NOTE : Insertion de l’aiguille trop peu profonde souvent traduit par perler liquide injecté de l’insecte (voir étape 2.15). Tout en regardant pour le mouvement du ménisque liquid dans l’aiguille, enfoncez le bouton d’injecter jusqu’à ce que la quantité désirée de liquide a été injectée. Pour les moustiques, si la valeur 50,6 aliquotes de nL, appuyez sur le 2 X pour ~ 100 nL ou 3 X pour ~ 150 nL. Pour les mouches domestiques, enfoncez le bouton d’injecter jusqu’à ~ 500 nL a été injecté (c’est-à-dire, avec 69 aliquotes nL Appuyez sur 7 X pour 483 nL). Si le ménisque ne bouge pas, lentement glisser le moustique ou l’aiguille s’envolent tout en regardant pour le mouvement du ménisque. Si une partie des perles solution injectée de la cuticule après retrait de l’aiguille, ou si le ménisque ne parvient pas à se déplacer, jeter l’insecte comme cette injection n’a pas réussie. Transférer les moustiques avec succès injectés dans les groupes de 10 à 15 ou mouches domestiques dans des groupes de 5 pour effacer 3.5 oz tenant des tasses. Couvrir avec tulle ou filet et récupérer à température ambiante. Après que les moustiques et les mouches ont récupérés (1 – 2 h), il faut inverser chaque tasse tenue sur une boule de coton imbibée d’une solution de sucrose à 10 %.Remarque : L’inversion de la tasse sur le dessus de la SIDA de coton de saccharose en survie en fournissant un accès plus facile pour un repas de sucre10. Aiguille de rinçage comme à l’étape 2.5 entre solutions d’injection. Quand fait par injection, jeter utilisé aiguilles dans un récipient approprié pour objets tranchants. 3. essai biologique de aedes aegypti , la mortalité et la ponte Pendant trois jours après l’injection, continuer à fournir des moustiques avec 10 % de sucrose et noter le nombre de moustiques visiblement morts. Remplir une membrane artificielle ≤ 12 pouces (tels que les boyaux de collagène de saucisse) avec du sang frais (c.-à-d. bovine pour Aedes aegypti) et faire chauffer jusqu’à 60 ° C en bain d’eau chaude. Brièvement, sécher la membrane en roulant sur une serviette en papier et déposer le long des caps de tulle du 3,5 oz clair tenant des tasses. Afin d’améliorer l’alimentation, doper le sang avec 1 mM ATP après la morcilla réchauffée avec les mains nues propre à quitter volatiles humains sur la surface du boîtier de chauffage comme un phagostimulant ou par la poignée. Après sang alimentation, remplacer la boule de coton imbibée de 10 % de saccharose sur les tasses de tenue et laissez les moustiques se reposer pendant ~ 24 h avant de les transférer aux tasses de ponte. Construct Ponte tasses en remplissant clairement 3,5 oz tasses de bioessai avec ~ 30 mL eau désionisée H2O et en plaçant un morceau de papier de germination de graines (~ 4 cm de large et 5 cm de long avec des crêtes vertical) au fond de la coupe et contre la paroi (Figure 3 a) . Couvrir avec tulle ou filet et couper une fente petite (~ 1 cm) dans le bouchon de tulle ou un filet. Au repas de sang après 24h, couper une fente petite (~ 1 cm) dans le bouchon de tulle de la tenue de coupe et de transférer seulement les femelles qui ont alimenté avec succès — avec un bolus de sang visible dans abdomen — par aspiration douce bouche dans les tasses de Ponte (1tasse femelle/Ponte). Sceller la petite incision dans le bouchon de ponte avec une boule de coton saturée de saccharose de 10 %. Contenir des tasses à environ 27 ° C pendant 5\u20127 jours pour permettre à moustiques à pondre pleinement tout en poursuivant la mortalité quotidienne. Compter les oeufs sous une dissection étendue. 4. essai biologique de Musca domestica , la mortalité et la ponte Pendant trois jours après l’injection, continuer à fournir les mouches avec 10 % de sucrose et noter le nombre de mouches visiblement morts. Trois jours après l’injection, anesthésier les mouches en plaçant brièvement un tube polyéthylène de débitant CO2 sur les tasses d’exploitation jusqu’à ce que toutes les mouches sont immobiles au fond des tasses. Transférer les mouches dans une cage propre, composée d’un pot en plastique de 4 L avec un manchon tubulaire en couvrant l’ouverture (10 cm ( Figure 3 b). Fournir des mouches avec de l’eau et un mélange de saccharose granulé, lait en poudre et séchée jaune de œuf dans un 8:8:1 ratio (en volume) pendant quatre jours, d’enregistrement et la suppression de mort vole tous les jours. Préparer les ingrédients secs pour un milieu d’élevage larvaire mouche frais en mélangeant 75 % son de blé avec 25 % granulés fourrage en poids. Ajouter de l’eau pour atteindre 62 % d’humidité (jusqu’à ce qu’une goutte d’eau peut à peine être évincée). Préparer une boule de diamètre de 2,5 cm d’un mélange de 1:1 des médias larves fraîches ci-dessus et « utilisés » volent larvaire moyen (moyenne où les mouches ont précédemment pupated). Envelopper la boule dans un carré de tissu de coton noir, serrez légèrement jusqu’à ce que le milieu liquide s’infiltre à travers, puis utiliser les bandes élastiques pour maintenir le tissu en place autour de la boule. Mettre la balle dans une tasse 60 mL et le placer dans la cage de voler pendant 5 h (Figure 3 b). Rincer les oeufs hors de la boule de ponte et veiller à ce que les œufs sont retirés sous plis dans le tissu. Secouez les œufs pour perturber les grappes et les transférer dans un tube à centrifuger jaugée de 20 mL avec une pipette de transfert. Attendez jusqu’à ce que les oeufs s’installer et noter le volume des oeufs sédentarisés dans le tube gradué. Ajouter suffisamment d’eau pour compléter le volume jusqu’à 20 X le volume des oeufs sédentarisés. Noter le volume total d’eau plus d’oeufs. Tout en mélangeant la suspension de l’eau et des oeufs avec une agitation magnétique bar ou brassage vigoureux, utiliser un embout de pipette de 1 mL (avec l’extrémité de la pointe coupée) pour distribuer 0,5 mL de la suspension de l’eau et des oeufs sur un morceau de tissu noir humide dans une série de lignes. Compter les oeufs sous un microscope à dissection. Répétez l’étape 4.9 deux fois plus. Si l’un des chefs d’accusation est une aberration grave (c.-à-d., diffère des deux autres comtes de > 35 %), de faire un quatrième chef et faire abstraction de la valeur aberrante. Calculer le nombre moyen d’oeufs par exemple et multiplier cette valeur par 2 pour obtenir le nombre d’oeufs/mL de la suspension. Multipliez la valeur oeufs/mL obtenue par le volume de la suspension de le œuf de l’étape 4,8. Il s’agit de l’estimation du nombre total de œufs pondus.