可重复的 dsrna 微注射和蚊子和家蝇的奥维恩生物测定

1. 昆虫准备 在4°c 下冷却蚊子数小时或在4°c 下暴露在二氧化碳中2分钟, 然后在注射前在4°c 下保持。在注射前 4°c 2\ u20120123 小时的冷麻醉苍蝇。如果产卵是反应变量, 确保蚊子和苍蝇交配。注: 蚊虫麻醉方法取决于物种和菌株,例如, 库蚊从冷麻醉中恢复的速度要比埃及伊蚊快得多, 因此 co2 击倒是可取的。 在冰上, 小心地放置蚊子或苍蝇, 方法是用柔软的钳子将它们放在显微镜幻灯片上, 它们的腹部暴露在大约0.5 厘米的距离。标准滑梯可容纳两排6种蚊子, 或6-7 只家蝇。在滑块的左侧或右端留出 1-1. 5 厘米的空间, 以帮助处理滑梯。 将上演的昆虫在4°c 的大型培养皿中保持滑落, 直到准备注射。注: 在培养皿盖上钻一个洞, 将有助于防止昆虫在封盖时受到空气置换的干扰。在固定在盘子底部的几块玻璃毛细血管上放置滑梯, 将方便地从培养皿中取出。 2. 昆虫注射 准备 dsrna, 如 edstep等人描述的那样.5和 Sanscrainte等人9. 如果不含污染物, 则可使用分光光度计测量260nm 的吸收率, 并计算以μg/ml 为a 260x 稀释因子 x40 的 rna 浓度。 在冷台上或浅层冰桶上设置解剖显微镜和微喷射器, 对冷麻醉蚊子和苍蝇进行注射 (见步骤1.1–1.3 和图 1)。 将玻璃毛细血管拉到带针头的细头 (设置: 加热器 = 15个单位, 电磁阀 = 4 a)。注: 有关制造商的详细信息, 请参阅材料表。 按照制造商的指示, 将毛细管针放入微喷射器中, 用一对钳子夹紧, 使针尖断裂, 从而产生尖尖。注: 建议的蚊虫开针尺寸为 ~ 150μm, 家蝇开针量 ~ 250μm。 为所需的输送量设置微喷射器。半月板运动从 ~ 50 nl 的 aliquots 是很容易观察到的, 建议蚊子微注射。如果可用, 请启用快速注射设置。用补充和排出无核酸酶水3次来冲洗针头。 准备注射溶液的浓度, 如 100\ u201150 nl 将提供所需的剂量的蚊子和 500 nl 将提供所需的剂量的家蝇。注: 建议的初始剂量: 每只蚊子1微克, 每只家蝇 5μg5,9。 对于蚊子, 在最终浓度为3.0μg/ml 的溶液中加入罗丹明 b (以帮助可视化)。注: 染料在腹部/胸部交叉口的腹侧表面几乎清晰的角质层注射后, 其粉红色将清晰可见。 移液器3-4μl 溶液注入干净的表面 (如一块石蜡膜), 并在不吸任何空气的情况下吸引到玻璃针中。反复按下注射按钮, 直到液体开始从针头上取下, 用精致的任务刮水器轻轻擦拭液滴。注: 虽然某些型号的微喷射器需要回填注射器, 但材料表中提到的注射器不需要回填。 使用超细点标记, 从液体半月板到针柄绘制相列标记 ~ 1 毫米。这将有助于可视化半月板运动, 并确保溶液在注射过程中进入蚊子体内。 将蚊子或苍蝇的滑行 (在第 1.2-1.3 步中准备) 设置在冰冷的桌子或冰上的针头下 (图 1)。确保显微镜中的视野足够宽, 可以看到针头中的溶液半月板。 对于蚊子, 将针头与中间三分之一的中半侧对齐 (图 2a), 在用放在另一侧的钳子将蚊子与针头对齐时, 用针头轻轻刺穿角质层。微喷射器千分尺。 对于家蝇, 将针头与介素 (图 2b) 对齐, 并在将苍蝇支撑在针头上的同时, 用针尖轻轻刺穿角质层。 轻轻将针头滑入蚊子或苍蝇体内, 直到尖端穿过中线。注: 插入针头太浅通常会导致注入的液体从昆虫中发出珠子 (参见步骤 2.15)。 在观察针头中液体半月板的运动时, 按下注射按钮, 直到注射所需的液体量。对于蚊子, 如果设置为 50.6 nl aliquots, 按2x 为 ~ 100 nl 或3倍为 ~ 150 nl。对于家蝇, 按下注射按钮, 直到注射了 ~ 500 nl (即,用 69 nl aliquots 按 7x 483 nl)。 如果半月板不动, 在观察半月板运动的同时, 慢慢地将蚊子滑倒或从针头上飞下来。如果注入的溶液的一部分在拔针时从角质层中发出珠子, 或者半月板不能移动, 则丢弃昆虫, 因为这种注射不成功。 转移成功地注射蚊子在小组10-15 或家庭苍蝇在5小组清除3.5 盎司举行杯。盖上薄纱或网状物, 在室温下回收。 蚊子和苍蝇恢复后 (1-2小时), 将每个拿着的杯子倒置在一个浸有10% 蔗糖溶液的棉球上。注: 将杯子倒置在蔗糖棉上, 通过提供更容易获得糖餐10, 有助于生存。 在注射溶液之间冲洗针头, 步骤2.5。注射完成后, 将用过的针头丢弃在适当的锐器容器中。 3.埃及伊蚊死亡率和产卵生物测定 注射后三天内, 继续向蚊子提供 1 0% 的蔗糖, 并记录明显死亡蚊子的数量。 用新鲜血液 (即埃及伊蚊牛) 填充≤12英寸人工膜 (如胶原蛋白香肠外壳), 并在热水浴中加热至60°c。 在纸巾上滚动, 将膜简单地擦干, 并躺在3.5 盎司透明的盛放杯的薄纱帽上。为了加强喂养, 在加热后, 用 1 mm atp 将血液作为兴奋剂, 或用干净的赤手空拳处理温暖的血液香肠, 将人体挥发物留在套管表面。 喂奶后, 将棉球更换为固定杯上10% 的蔗糖, 并让蚊子休息约 24小时, 然后转移到产卵杯。 通过填充约30毫升去离子化 h2o 的透明3.5 盎司生物测定杯, 并在杯底和侧面放置一张种子萌发纸 (约4厘米宽, 长5厘米, 脊垂直运行), 从而构建产卵杯 (图 3 a).盖上薄纱或网状物, 在薄纱或网帽上切一个小缝隙 (~ 1 厘米)。 在24小时后喂养时, 在托杯的薄纱帽中切开一个小缝隙 (~ 1 厘米), 并将仅在腹部用可见血丸的单个雌性进行移植, 将其吸进产卵杯 (1个女性卵泡杯)。用10% 的蔗糖饱和棉球密封产卵帽的小伤口。 将杯子保持在 ~ 27°c 5\ u20127天, 以允许蚊子完全排卵, 同时跟踪每日死亡率。在解剖范围内计算鸡蛋数。 4.家蝇死亡率和产卵生物测定 注射后三天, 继续为苍蝇提供 1 0% 的蔗糖, 并记录明显死亡苍蝇的数量。 注射三天后, 麻醉苍蝇, 通过短暂放置聚乙烯管分配二氧化碳在举行的杯子, 直到所有苍蝇在杯底一动不动。 将苍蝇转移到一个干净的笼子里, 这个笼子由一个4升的塑料罐组成, 开口上有一个 stockinette 套筒 (10 厘米,图 3 b)。以8:8:1 的比例 (按体积) 为苍蝇提供水和粒状蔗糖、奶粉和蛋黄干的混合物, 为期四天, 每天记录和清除死苍蝇。 将75% 的小麦麸皮与25% 的粒状牲畜饲料按重量混合, 为新鲜苍蝇幼虫养殖培养基准备干原料。加水达到62% 的水分 (直到一滴水几乎无法挤出)。 从上述新鲜幼虫培养基和 “使用的” 苍蝇培养基 (苍蝇以前在其中成虫的培养基) 的1:1 混合物中制备直径2.5 厘米的球。将球包裹在一块方形的黑色棉布中, 轻轻挤压, 直到介质液体渗出, 然后用橡皮筋将布固定在球周围的位置。 将球放入60毫升杯中, 并将其放入飞笼中 5小时 (图 3b)。 将卵从产卵球上冲洗掉, 并确保将鸡蛋从布内的褶皱下取出。摇蛋, 以扰乱集群, 并将它们转移到一个毕业的20毫升离心管与转移管。 等到鸡蛋沉淀下来, 并注意到在刻度管中的沉淀鸡蛋的体积。加入足够的水, 使体积达到20x 的沉淀蛋的体积。记录水加鸡蛋的总量。 将水和鸡蛋悬浮液与磁搅拌棒或剧烈搅拌混合时, 使用1毫升的移液尖端 (尖端的末端被切断) 将0.5 毫升的水和鸡蛋悬浮液分配到一系列的预湿黑布上。在解剖显微镜下数一数鸡蛋。 重复步骤4.9 两次。如果其中一个计数是严重的异常值 (即, 与其他两个计数不同的 gt;35%), 则进行第四个计数并忽略异常值。 计算每个样本的平均卵数, 并将此值乘以 2, 以获得悬浮液的鸡蛋数量。将从步骤4.8 中的卵子悬浮量获得的 eggss/ml 值相乘。这是对产蛋总数的估计。