دسرنا استنساخه Microinjection و "الحشري أوفيبوسيتيون" في البعوض والذباب البيت
Summary
ويصف هذا البروتوكول منهجية microinjection لدينا موحدة واستخدمت لعدة سنوات بتسليم كميات معينة من الأحماض النووية مباشرة إلى hemolymph من البعوض والذباب البيت. هذا البروتوكول يؤدي إلى وفيات حقن الحد الأدنى ويسمح قياسات الجرعات ارتباطاً من خصوبتها.
Abstract
دسرناس الاصطناعية، تستخدم للحث على تدخل الجيش الملكي النيبالي، قد آثار الجرعة تعتمد المظهرية. هذه الآثار من الصعب تحديد إذا تم تسليم دسرناس استخدام أسلوب غير كمي. دقة تسليم كميات معروفة من الأحماض النووية أو المواد الكيميائية الأخرى أمر بالغ الأهمية لقياس فعالية المجمع يجري اختبارها والسماح موثوقة مقارنة بين المركبات.
هنا نقدم بروتوكول microinjection استنساخه، والكمية التي تضمن دقة إيصال جرعات محددة من دسرنا، خفض معدل الوفيات عادة الناجم عن الإصابة الحقن. وتشمل هذه التعديلات إضافة “ب والرودامين”، إبرة حقن متدرجة، وأسلوب تحسين استرداد اقترضت من إيزوي وكولينز. هذا الأسلوب يسمح حساب الجرعة الردود ويسهل إجراء المقارنات بين المركبات. قد استخدمت إصدارات من هذا الأسلوب بنجاح في ثلاثة أجناس البعوض، فضلا عن الذباب البيت لتقييم الانخفاض في الخصوبة الناتجة عن إسكات الجينات الحمض النووي الريبي الريباسي النصوص.
يوفر هذا البروتوكول استراتيجيات للحد من العديد من التحديات ل microinjection الحشرات الصغيرة. تسليم دسرناس مصحوبة بالتحقق البصري معا، والميكانيكية، ضمان تحديد مواقع فعالة للتسليم، وإدراج فترة الانتعاش بعد حقن جرعات دقيقة والوفيات الناجمة عن الإصابات منخفضا. ويصف هذا البروتوكول أيضا الحشري أوفيبوسيشن لتصميم موحدة من تأثيرات على الخصوبة.
Introduction
تسليم الجزيئات الحيوية الصغيرة، مثل الأحماض النووية، للكبار ديبتيرانس ثبت أن يشكل تحديا في Culicidae ومسكيدي. تم الإبلاغ عن استيعاب شفوي من دسرناس إنتاج العقم (عند استهداف جينات حصرا المعرب عنها في الخصيتين للبالغين) والوفيات (عند استهداف SNF7 وكواكتيفاتور مستقبلات ستيرويد) في يرقات بعوض الزاعجة المصرية1،2 . الوفيات قد لوحظ أيضا عند استهداف HSP70 في اليرقات مستأنسة الذبابة3. هذه التأثيرات المظهرية، ومع ذلك، لم تؤد إلى بعد تغذية دسرنا للكبار عبد اللطيف-مصرية في السكر الوجبات4،5.
وقد استخدمت microinjection للتحايل الأمامي عند الأخذ بالعوامل الممرضة أو الأحماض النووية، مما يحفز استجابة المنظومة5،6،،من78،9،10 . توجد العديد من التقنيات microinjection، التي تشمل معدات تتراوح ما بين الأجهزة المنتجة داخل المنظمة التي تتطلب قياس حجم الحقن بالحقن تسيطر على المعالجات الدقيقة التي تسمح بإيصال التخزين الآلي منخفضة تصل إلى 2.3 البصرية nL 5 , 9 , 10 , 11-الجيش الملكي النيبالي المشغلات التدخل ([رني]) استهداف مرناس ريبوسومال، عرقلة التنمية المبيض في المفصليات متنوعة القراد الماشية ميكروبلوس رهيبيسيفالوس، البعوض Culex pipiens، و بعوض الزاعجة المصرية وذبابة المنزل مستأنسة الذبابة5،9،،من1213. في هذه الدراسات، ورصد تعطل أوفيبوسيشن ضروري لتحديد فعالية إينوكولانت كما قد تتظاهر النمط الظاهري كإنهاء أو الحد من النسل. هذا هو نموذج للنمط الظاهري قاتلة بين الأجيال هو تأثير حاسم والمطلوب في العديد من الأساليب غير التقليدية لذالك مثل ولبخيه-إصابة الذكور مقدمة (عدم التوافق الجنسي) و [رني] التي يسببها العقم5 9، ،14. تتبع كل من الوفيات والخصوبة ضروري لتميز وتطوير بيوراتيونالس محددة للغاية (مسببات الأمراض التي تحدث بشكل طبيعي و/أو المشتقات الطبيعية)15.
هذا البروتوكول يقدم تقنيات microinjection مفصلة للكبار البعوض والذباب البيت؛ هي عملية غالباً ما لا يوصف كذلك في الأدب. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف أوفيبوسيشن الحشري منهجيات لتقييم آثار دسرنا على ديبتيرانس الكبار على نحو كاف. هذه البروتوكولات وضعت خصيصا بعوض الزاعجة المصرية و الذبابة مستأنسة ولكن يمكن تعديله للأنواع الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection أسلوب المعملية قيماً لضمان تسليم دسرنا أو بيوراتيونالس الأخرى (أي، مبيدات الآفات، والفيروسات، microsporidia). بينما تؤدي العديد من المختبرات microinjection، المبلغ بالضبط حقن غالباً غير واضح بسبب قيود تقنية نظام التسليم بحيث وحدة تخزين تم تسليمها لا يقاس مباشرة11. وحدة تخزين تم تسليمها وتركيز المعلمات الحرجة التي تسمح لحساب قياسي التدابير السمية مثل EC50 أو IC50 أو لتعريف الحد الأدنى الفعال جرعات5،16. وهذا مهم بشكل خاص في الدراسات الفنية باستخدام [رني] في الحشرات البالغة، حيث التسليم عن طريق التغذية لا يؤدي دائماً الجهازية التعرض للجسيمات المرجوة والجرعة الفعلية عبور الأمامي غير واضحة5.
بينما يمكن أن يكون الإجراء microinjection في البداية الصعبة، تتحقق تحسينات سريعة في دقة السرعة والتسليم مع الممارسة والصبر. إتقان الإجراء حقن نفسه استثمار وقت، ولكن مجرد إنجاز الإجراء ينتج نتائج قابلة للتكرار، والوفيات الناجمة عن الإصابات من < 3%. سيتم زيادة نسبة نجاح الحقن إجادة يزيد الحقن مما يسمح للبعوض 300 أو الذباب يوميا.
العديد من تحديات microinjection بسبب الإبرة المستخدمة. تحديد نقطة فاصل الإبرة الشعرية السليمة وزاوية نصيحة جانبا تحديا للإجراء وتتطلب بعض التجربة والخطأ لتحديد حجم الافتتاحية الأكثر فعالية لنوع معين. غرامة إبرة الأكثر فائدة للبعوض microinjection (~ 150 ميكرومتر) صغير جداً لسرعة تسليم حقن الذباب بينما على العكس من ذلك، الإبرة أكبر فتح أن يعمل على الذباب (~ 250 ميكرومتر) يتسبب في أضرار الإصابة الواسعة للبعوض أصغر حجم أكبر ووفيات الحقن غير مقبول. وكثيراً ما إبرة مكسورة مع تلميح كليلة من الصعب الحصول على عن طريق بشرة دون الأضرار الأنسجة وزيادة في معدل الوفيات. يمكن أن تسد جداول الحشرات أو قطع الأنسجة الإبر على مدى التجربة، حيث أنها غالباً ما تكون مفيدة للابر عدة انسحبت إذا استبدال مطلوب. وقد وجدنا أنه من الأسهل يحل محل إبرة صعبة بدلاً من قضاء بعض الوقت في محاولة لمسح إبرة التشويش أو عرقلة.
مراقبة دخول الحشرة الحل حقن أمر بالغ الأهمية حيث أن الحقن غير ناجحة يمكن إزالتها (انظر الخطوات 2.14 2.15). ويوفر والرودامين ب بالإضافة إلى حقن الحلول البصرية واضحة لضمان تلقي الجرعات المناسبة الحشرات نظموا الباردة ومفيد بشكل خاص أثناء ممارسة (راجع الخطوة 2.7).
حقن وأوفيبوسيشن أساليب العينة المعروضة هنا بنجاح التي يتسبب فيها الجينات تأثيرات المظهرية ضربة قاضية وقابلة للقياس في الكبار Ae. مصرية و مستأنسة م. عند استخدام دسرناس مصممة ضد إبلاغها ريبوسومال محاضر (الشكل 4 و الشكل 5 ألف). بالإضافة إلى ذلك، يتيح قدرة هذا الأسلوب على دقة تسليم ميكروفولوميس للأفراد للجرعة منحنيات الاستجابة إلى يتم إنشاؤها لكميات صغيرة من المواد (ما يصل إلى 50 نانوغرام؛ الشكل 5 (ب)). وهذا مفيد بشكل خاص لأساليب مثل فحص سيرناس أو دسرناس، كما تنتج كميات كبيرة من هذه الجزيئات يمكن أن تكون باهظة التكلفة.
يمكن تعديل هذا الأسلوب لحقن المواد البيولوجية (الفيروسات والبكتيريا، microsporidia) أو مبيدات الآفات الكيميائية، بعد التأكد من أن أي المخازن المؤقتة للتسليم حميدة بالحقن. كما يقتصر حجم التسليم بحجم الحشرة، المنتجة تتركز اختبار الحلول لها أهمية.
لتقييم فعالية دسرنا على نحو كاف، من الضروري أن تتبع أوفيبوسيشن كما تعمل الفتاكة قد تتظاهر فقط في ذرية. كما عرضت هنا، عقد الإناث Ae-مصرية بشكل منفصل بعد بلودينج يسمح لتحديد حجم مخلب الفردية، ويمكن أن يتم إجراء مزيد من التجارب على نفس الأفراد المتلقين للمعلومات من أوفيبوسيشن (أي دراسات التعبير الجيني، جونوتروفيك إضافية دورات، ضربة قاضية خاصة الأنسجة) للربط بين مخرجات الإنجابية مع تدابير أخرى مثل التعبير الجيني. كما مستأنسة م. أوفيبوسيت عموما في استجابة فريق، التحريض على الذباب جرابيد معزولة إرساء هو جداً العمل المكثف وغير عملي لإعداد كبيرة من الأفراد17. لذلك، يعرض طريقة لتحديد حجم مخلب يعني.
يوفر الأسلوب microinjection المعروضة هنا التسليم منهجية متسقة للبعوض والذباب البيت. مقترنة بوفيات وأوفيبوسيشن تتبع المقايسة، تنوعاً استخدام هذه الأدوات يمكن لتقييم آثار النسخي والمظهرية لجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة والعوامل البيولوجية، ومبيدات الآفات التقليدية حيث التسليم الشفوي غير قابلة للبقاء.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون هانايو اريموتو (البحرية الأمريكية)، دانا جونسون ولي لوسي والأبيض روكسي (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية) للمساعدة في الحصول على البيانات وتحليلها. كما نشكر الدكتور بيا أولافسون (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية) ووو كه (جامعة فلوريدا) لاستعراض دقيق للمخطوط وهوستيتلير نيكلاوس (جامعة فلوريدا) لتصوير لقطات المجهر. تم توفير التمويل بوزارة الزراعة، المشروع ج وي-141 من البحرية ومركز الصحة العامة في سلاح البحرية، ونشر برنامج حماية مقاتلي الحرب. وكان الممولين أي دور في تصميم أو الاتجاه للدراسة أو التطوير من المخطوطة.
Materials
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G., Colpitts, T. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. 1435, 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
