Isolering av tissue ekstracellulære blemmer fra leveren

Alle studier som involverer dyr ble utført i samsvar med en protokoll som ble godkjent av Mayo Clinic institusjonelle Animal Care og use Committee. 1. benk forberedelse Forbered et vannbad og sett den til 37 ° c. Det andre nødvendige utstyret og oppsettet er vist i figur 1. Mål 100 mg kollagenase type IV og legg den til en 125 mL kolbe som inneholder 100 mL HBSS i et vannbad (40 ° c). Sørg for at kollagenase er oppløst ved å virvler væsken i flasken, og Pass også på at flasken er fullstendig nedsenket i vannbadet. For større effektivitet, la kollagenase å oppløse i minst 30 min selv om det kan synes å oppløse umiddelbart. Senk en 125 mL kolbe som inneholder 50 mL HBSS i et vannbad ved 40 ° c. Dette vil bli brukt for første trekk. Spray ned overflaten av alle instrumenter som saksen og pinsett med 70% etanol. Forbered noen rene bomullspinner. Skyll ut slangen på pumpen ved å kjøre 70% etanol gjennom pumpen og fjerne eventuelle gjenværende etanol ved å skylle den to ganger med rennende vann. Legg en absorberende benk pad på laboratoriebenken og Plasser en hard boks beholder øverst. Dette vil være nødvendig for å inneholde overflødig væske under musen. Pakk en polystyren skum pad med aluminiumsfolie og legg den inne i beholderen. Plasser en steril 10 cm kultur rett nær benken. Dette vil bli brukt til å holde fordøyd leveren etter at den er ferdig. Hell 10 mL kollagenase medium (trinn 1,2) inn i en steril kultur rett på forhånd. Ved hjelp av en vinge blod samling sett, koble 23-gauge til den frie enden av pumpeslangen (kutte vingene av sommerfuglen kanyle kan føre til bedre håndtering). Pass til tuppen av kanyle av blod samlingen er fylt. 2. Animal forberedelse Før du starter anestesi ved hjelp av isoflurane, sørg for at en tilstrekkelig mengde av forsynings gass er tilgjengelig for varigheten av prosedyren. Slå på oksygen (O2) forsyning til induksjon kammeret på 1-2 L, og slå på isoflurane mellom 2-4% ved hjelp av en flowmeter. Sett musen inn i induksjon kammer og Lukk toppdekselet. Overvåk musen til den er tilbakelent.Merk: gassene i kammeret vil holde mus anesthetized i flere minutter. Plasser musen på en polystyren skum pad innpakket med aluminiumsfolie. Bytt flyten fra induksjon kammeret til en nosecone. Sørg for at anestesi er tilstrekkelig. Hvis musen har begynt å reagere, forsiktig holde den i en nese kjegle til den er helt anesthetized. Sørg for anestesi ved å overvåke åndedrett og respons på stimulering under inngrepet. Juster hastigheten flowmeter etter behov for å sikre tilstrekkelig anestesi. Den poter må avslutte til knipe test under anestesi. Ytterligere detaljer kan fås fra laboratoriet guide for omsorg for dyr. Tape eller PIN ned alle fire lemmer av musen. Rengjør huden over magen ved sprøyting med 70% etanol og tørk den av med gasbind og en alkohol pute. Dette trinnet er avgjørende for å unngå forurensning fra musen pels. Lag en vidåpne skjære gjennom huden fra fremre til bekkenet beinet ved hjelp av et sett av sterile saks. Vær forsiktig så du ikke kutte noen indre organer. Fortrenge tarmen til dyrets venstre side ved hjelp av en bomulls spiss applikator for å forsiktig for å eksponere portalen vene (PV) og dårligere vena cava (IVC). 3. kanyleringen og (0,5 h) Ved hjelp av buet tang, plassere en tråd under portalen vene og knyt en knute løst for å forberede helmkompatibel tett etter kanyleringen. Sett inn kanyle (23G fra blodprøvetakingssettet) i portalen vene 5-10 mm under ligatur. Ikke sett inn kanyle forbi den første portalen gren, ellers høyre fremre flik kan være utilstrekkelig perfusert. Kanyle kan festes eller festes med tråd ved hjelp av en propp knute. Start pumpen for å sette mot i HBSS ved lav strømningshastighet (1-2 mL/min). Når kanyleringen er bekreftet å være vellykket, leveren vil begynne å Blanch. Skjær IVC å avlaste trykket og la overdreven væske i leveren til å renne. Dette er best utført ved hjelp av operatørene andre hånden slik at kanyle ikke er flyttet. Øk strømningshastigheten langsomt til 8 mL/min og Fullfør den med hele 50 mL volum HBSS gjennom leveren, i løpet av de neste 5 min. Endre kollagenase som inneholder medium (trinn 1,2) til begeret like før HBSS begynner å renne ut. Sørg for at luftbobler ikke er tilstede og ikke strømme inn i leveren når du skifter medium. Påfør forbigående trykk til IVC ved 5 s intervaller ved å klemme med tang. Dette vil føre til at leveren til å hovne opp og hjelpe med vev fordøyelsen og dissosiasjon (7-8 min). Som fordøyelsen utvikler seg, vil leveren hovne opp og bli hvit. Leveren kan hovne opp jevnt til omtrent to ganger sin opprinnelige størrelse. Slå av pumpen og fjerne kanyle når fordøyelsen er fullført. Fullføringen av leveren fordøyelsen vil avhenge av størrelsen på musen og tilstanden til leveren. En bulk i leveren kan observeres hvis en bomulls-tippet applikator brukes til forsiktig sonde leveren. Fjern galleblæren fra leveren, være forsiktig så du ikke rive den. Ved hjelp av en vasket saks og pinsett, trekke ut leveren fra musen til en steril 10 cm kultur parabolen inneholder fosfat-bufret saltvann (PBS) for overflate vasking. Overfør leveren forsiktig inn i steril 10 cm kultur parabolen inneholder kollagenase medium (fra trinn 1,8). Dette er et kritisk skritt for å unngå forurensning fra musen blod og galle. Grip og rive fra hverandre leveren med to rene tang mens forsiktig rister cellene fra leveren. Som dette skjer, vil mediet bli formørket. Alle hepatocytter kan ristes bort, etterlot bindevev og vaskulær vev. Triturate cellen løsningen mange ganger ved hjelp av en 3 mL sprøyte til ufordøyd deler av leveren er ristet av. Hell den av i en 50 mL konisk rør med 70 μm nylon celle siler å filtrere noen ufordøyd bindevev. Vask parabolen med HBSS å samle de resterende cellene og fylle opp 50 mL konisk rør. Sentrifuger mykt 50 mL konisk slange i en svingende skuffe rotor ved 50 x g i 10 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt 50 mL konisk rør. 4. isolering av EV-er (5 h) Sentrifuger supernatanten ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt 50 mL konisk rør. Sentrifuger supernatanten ved 2000 x g i 20 min ved 4 ° c for å fjerne celle rester og aggregater. Overfør supernatanten til et rundt bunn rør og sentrifuger supernatanten ved 10 000 x g i 70 min. ved 4 ° c. Samle supernatanten og plasser i en polykarbonat ultracentrifuge tube og sentrifuger på 100 000 x g for 70 min ved 4 ° c. Samle pellet i en ultracentrifuge tube som deretter vaskes ved å re-suspendere i PBS. Sentrifuger supernatanten ytterligere ved 100 000 x g for 70 min. ved 4 ° c. Den siste pellet består av cellulære nanovesikler kan brukes direkte for eksperimenter eller re-suspendert med 1000 μL av PBS og lagret ved-80 ° c. 5. vurdering av kvalitet og utbytte av isolasjoner Vurder størrelsesfordelingen og konsentrasjonen ved hjelp av nanopartikkel sporings analyse eller tunable pulsmåling etter maskin produsentens protokoller. Utføre ytterligere isolering og rensing av spesifikke vesicle populasjoner av ulike tilnærminger som tillegg av en sukrose gradient eller pute, immunoaffinity teknikker, eller størrelse eksklusjon kromatografi, basert på spesifikke eksperimentelle behov.