Isolering af vævs Ekstrudulære vesikler fra leveren

Alle undersøgelser, der involverer dyr, blev udført i overensstemmelse med en protokol, som blev godkendt af Mayo Clinic Institutionsudvalg for dyrepasning og-brug. 1. forberedelse af bænken Forbered et vandbad og sæt det til 37 °C. Det andet nødvendige udstyr og opsætning er vist i figur 1. Mål 100 mg kollagenase type IV og tilsæt det til en 125 ml kolbe, der indeholder 100 ml hbss i et vandbad (40 °c). Sørg for, at kollagenase er opløst ved at hvirvle væsken i kolben, og Sørg også for, at kolben er helt nedsænket i vandbad. For større effektivitet, tillader kollagenase at opløse i mindst 30 minutter, selv om det kan synes at opløse øjeblikkeligt. En 125 mL kolbe, der indeholder 50 mL HBSS i et vandbad ved 40 °C, nedsænkes. Dette vil blive brugt til indledende træk. Spray ned overfladen af alle instrumenter såsom saks og pincet med 70% ethanol. Forbered nogle få rene vatpinde. Skyl slangen af pumpen ved at køre 70% ethanol gennem pumpen og fjern eventuel resterende ethanol ved at skylle det to gange med rindende vand. Læg en absorberende bænk på laboratorie bænken, og Placer en hård kasse beholder på toppen. Dette vil være nødvendigt at indeholde eventuelle overskydende væsker under musen perfusion. Wrap en polystyren skum pude med aluminiumsfolie og placere den inde i beholderen. Placer en steril 10 cm kultur skål tæt på bænken. Dette vil blive brugt til at holde den fordøjet leveren efter perfusion er afsluttet. Hæld 10 mL kollagenase medium (trin 1,2) i en steril kultur skål på forhånd. Ved hjælp af et bevinget blodindsamlingssæt skal du tilslutte 23-måleren til den frie ende af pumpeslangen (skæring af vingerne fra sommerfuglkanylen kan føre til bedre håndtering). Passere, indtil spidsen af kanylen på blod samlingen er fyldt. 2. tilberedning af dyr Før du starter anæstesi med isofluran, skal du sørge for, at der er en tilstrækkelig mængde gasforsyning til rådighed i hele procedurens varighed. Tænd oxygen (O2) forsyningen til induktions kammeret ved 1-2 L, og tænd derefter isofluran mellem 2-4% ved hjælp af en flowmeter. Sæt musen ind i induktions kammeret og luk den øverste dør. Overvåg musen, indtil den er rekumbøjet.Bemærk: gasserne i kammeret vil holde musene bedøvet i flere minutter. Placer musen på en polystyren skum pude indpakket med aluminiumsfolie. Skift strømmen fra induktions kammeret til en nosecone. Sørg for, at anæstesi er tilstrækkelig. Hvis musen er begyndt at reagere, forsigtigt begrænse den i en næse kegle, indtil den er fuldt bedøvet. Sørg for anæstesi ved at overvåge respiration og respons på stimulation under proceduren. Justér hastigheds flowmeteret efter behov for at sikre tilstrækkelig anæstesi. Poterne skal være responderende til Pinch Test under anæstesi. Yderligere oplysninger kan fås ved henvendelse til laboratorie vejledningen til pasning af dyr. Tape eller PIN ned alle fire lemmer af musen. Rengør huden over maven ved at sprøjte med 70% ethanol og tørre den af med gaze og en spritserviet. Dette trin er afgørende for at undgå kontaminering fra musen pels. Lav et bredt åbent snit gennem huden fra den forreste til bækken knoglen ved hjælp af et sæt steril saks. Vær omhyggelig med ikke at skære nogen indre organer. Fortrænge tarmene til dyrets venstre side ved hjælp af en bomulds tippet applikator til forsigtigt at udsætte Portal vene (PV) og ringere Vena cava (IVC). 3. cannulation og perfusion (0,5 h) Brug buede pincet, Placer en tråd under portalens vene og binde en knudeløst for at forberede bagpå stramt efter kanylering. Sæt kanylen (23G fra blodindsamlings sættet) ind i Portal vene 5-10 mm under ligatur. Indsæt ikke kanylen forbi den første Portal gren, ellers kan den højre forreste lap være utilstrækkeligt perfekceret. Kanyle kan fastgøres eller fæstnet med gevind ved hjælp af en prop knude. Start pumpen for at tilføre HBU’ERNE en lav strømningshastighed (1-2 mL/min). Når kanylen er bekræftet at være vellykket, leveren vil begynde at Blanch. Skær IVC til at lindre trykket og tillade overdreven væske i leveren til at dræne. Dette er bedst udføres ved hjælp af operatørerne anden hånd, så kanylen ikke flyttes. Langsomt øge strømningshastigheden til 8 mL/min og fuldføre perfusion ved hjælp af hele 50 mL volumen af HBSS gennem leveren, over de næste 5 min. Skift det kollagenase-holdige medium (trin 1,2) ind i bægerglasset, lige før HBU’ERNE begynder at løbe tør. Sørg for, at luftbobler ikke er til stede og ikke strømmer ind i leveren, når mediet skiftes. Anvend forbigående tryk til IVC med 5 s intervaller ved at fastspænde med tang. Dette vil få leveren til at svulme og hjælpe med vævs fordøjelse og dissociation (7-8 min). Som fordøjelsen skrider frem, leveren vil svulme og blive hvid. Leveren kan svulme ensartet til omtrent to gange sin oprindelige størrelse. Sluk for pumpen og fjern kanylen, når fordøjelsen er fuldført. Færdiggørelsen af lever fordøjelsen vil afhænge af størrelsen af musen og tilstand af leveren. En bule i leveren kan observeres, hvis en bomuld-tippet applikator anvendes til forsigtigt at sonde leveren. Fjern galdeblæren fra leveren, at være omhyggelig med ikke at rive den. Ved hjælp af et vasket par saks og pincet, udtrække leveren fra musen til en steril 10 cm kultur skål indeholdende fosfat-bufferet saltvand (PBS) til overflade vask. Overfør leveren omhyggeligt til den sterile 10 cm kultur skål indeholdende kollagenase medium (fra trin 1,8). Dette er et kritisk skridt for at undgå kontaminering fra mus blod og galde. Grib og Riv leveren med to rene pincet, mens du forsigtigt ryster cellerne fra leveren. Da dette sker, vil mediet blive overskyet. Alle hepatocytter kan rystes væk, efterlader bindevæv og vaskulære væv. At triturere celle opløsningen mange gange ved hjælp af en 3 mL sprøjte, indtil de ufordøjet dele af leveren er rystet af. Hæld det ud i en 50 mL konisk rør med 70 μm nylon celle-strainere til at filtrere eventuelle uforfordøjet bindevæv. Vask skålen med HBSS for at samle de resterende celler og fylde 50 mL konisk slange. Centrifuger forsigtigt 50 mL konisk slange i en svingende skovl rotor ved 50 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten overføres til et nyt 50 mL konisk rør. 4. isolering af evt (5 timer) Supernatanten centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt 50 mL konisk rør. Supernatanten centrifugeres ved 2000 x g i 20 minutter ved 4 °c for at fjerne cellerester og aggregater. Supernatanten overføres til et rør med rund bund, og supernatanten centrifugeres ved 10.000 x g i 70 min ved 4 °C. Supernatanten opsamles og placeres i en polycarbonat ultracentrifuge tube og centrifugeres ved 100.000 x g i 70 min ved 4 °C. Saml pellet i en ultracentrifuge tube, som derefter vaskes ved at re-suspension i PBS. Supernatanten centrifugeres yderligere ved 100.000 x g i 70 min ved 4 °C. Den endelige pille, der består af cellulære nanovesikler, kan anvendes direkte til forsøg eller genudsættes med 1000 μL PBS og opbevares ved-80 °C. 5. vurdering af kvaliteten og udbyttet af isoleringer Vurder størrelsesfordelingen og koncentrationen ved hjælp af nanopartikel tracking analyse eller tunable resistive puls sensing efter instrument producentens protokoller. Udføre yderligere isolering og rensning af specifikke vesikle populationer ved forskellige tilgange såsom tilsætning af en saccharose gradient eller pude, immunoaffinitets teknikker eller størrelses udelukkelse kromatografi, baseret på specifikke eksperimentelle behov.