Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Не хорошо понимают роль лимфатические сосуды и МГС в печени. В то время как лимфатические сосуды находятся в пределах портала Триада печени¹ и расширять во время болезни², очень мало понимается относительно функции и фенотип МГС в печени. С открытием маркеров, которые находятся главным образом на МГС³важность этих клеток в различных тканей ниши в гомеостаза и болезни будет заполнить значительный пробел в нашем понимании. МГС играют важную роль в поддержании периферийных терпимости в лимфатических узлов и метастатические опухоли, взаимодействуя непосредственно с T клетки^{4,5,6,,78, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. МГС в лимфатических узлов может способствовать защитный иммунитет через их взаимодействие с мигрирующие дендритные клетки^14,,1516. Таким образом существует несколько ролей для LECs, которые могут быть специфическими для тканей и взаимодействия, в которых они присутствуют. Однако очень мало понимается как LECs взаимодействуют с иммунных клеток в тканях или как LECs функционируют в различных органов и систем; Таким образом оценки МГС на основе за клеток в печени или других органов может привести к достижения в LECs, как программы ткани конкретных иммунитета. Хотя большая часть литературы, которая сосредотачивается на МГС в печени использует микроскопии для визуализации LECs, используя один или два маркеры и морфология¹⁷, очень мало было сделано для конкретно оценить МГС на основе по ячейкам с помощью проточной цитометрии, хотя одно исследование оценить различия между синусоидального эндотелиальных клеток печени (LSECs) и МГС¹⁸. Возможность анализировать LEC населения в печени подачей cytometry позволяет для углубленного изучения LEC фенотип во время нормальной гомеостаза или болезни.

Чтобы оценить LECs подачей cytometry, необходимы несколько поверхностных маркеров. Как правило LECs визуализируются выражение связанных с Просперо гомеобокс 1 (Prox-1), лимфатический сосуд эндотелиальной гиалуроновая кислота рецепторов 1 (LYVE1) или Сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептор 3 (VEGFR3) с помощью микроскопии. Однако в печени, выражение этих маркеров не ограничивается МГС. Prox-1 широко выражается гепатоцитов во время регенерации печени развития и травмы¹⁹, и LYVE1 и VEGFR3 являются выраженные эндотелиальных клеток печени синусоидального¹⁸. В лимфоузел, LECs идентифицируются с помощью проточной цитометрии как кластеры дифференциации (CD) CD45 – CD31 + и podoplanin + (PDPN)¹⁶. Однако этот подход является слишком минимальной, чтобы изолировать МГС в печени, так как CD45 – CD31 + клетки будет захватить эндотелиальных клеток, а преобладающее население сосудистой эндотелиальных клеток в печени LSECs. Таким образом другие маркеры необходимо различать редких LEC населения с обильным LSEC населения. CD16/32 (выраженные Зрелые LSECs¹⁸) и CD146 (общий сосудистый эндотелиальных клеток маркер, преимущественно, выраженные в печени синусоиды²⁰ синусоидального эндотелиальных клеток печени с практически не выражение лимфатической эндотелиальные клетки²¹) были кандидат маркеров.

Таким образом мы оптимизированный метод для изоляции и визуализации МГС в печени, используя выше маркеров, CD45, CD31, CD146, CD16/32 и PDPN для проточной цитометрии. Мы описывают использование коллагеназы IV, DNase 1 и механического разделения для переваривания ткани печени в одну ячейку подвеска. Мы также описывают использование градиента плотности iodixanol для изоляции не Паренхиматозный клеток (NPC) и ликвидации сотовой мусора. Наконец мы с использованием нескольких маркеров, определить оптимальный поток цитометрии стробирования стратегию для выявления LECs из печени с PDPN как основной маркер.