Nichtinvasiver In-Pen-Ansatztest für Imlabor-Schweine

Leichte Verletzungen des Gehirns, die nicht zu übertüben anatomischen und strukturellen Veränderungen führen, die mit modernster Bildgebung nachweisbar sind, können schwierig zu identifizieren und zu behandeln sein²⁸. Patienten mit mTBI sind jedoch besonders anfällig für zusätzliche Beleidigungen, die erhebliche Schäden am Gehirn verursachen können, und daher ist es wichtig, dass diese Population identifiziert wird. Verhaltenstests, die in einem Mini-Schweinemodell von mTBI entwickelt wurden, sind besonders für menschliche mTBI-Patienten relevant, da Schweine eine ähnliche Physiologie wie Menschen haben und ähnliche affektive Zustände wie Anhedonia^{8,9,10 ,20}. Hier haben wir einen nichtinvasiven In-Pen-Verhaltenstest (den HAT) entwickelt und gezeigt, dass er empfindlich genug ist, um mTBI-Schweine von Scheinschweinen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurde ein gewichteter Index (die KI) für Während des HAT beobachtete Verhaltensweisen entwickelt, die in allen Gehäuse- und Schweinetypen allgegenwärtig sind.

Änderungen und Fehlerbehebung:

Die Methoden für den HAT wurden auf der Grundlage der ethologischen Leitlinien²⁵ und mehrerer Trial-and-Error-Strategien zur Verbesserung der Zuverlässigkeit, Wiederholbarkeit und Gültigkeit des Tests⁶festgelegt. Zuverlässigkeitsmaßnahmen halfen dabei, die Stärken und Grenzen des Tests zu identifizieren. Zuverlässigkeit definiert das Ausmaß, in dem die Messung wiederholbar und konsistent und frei von zufälligen Fehlern ist^28,29. Wir haben bereits über die Intra- und Interobserver-Zuverlässigkeit des HAT berichtet, und mit den zusätzlichen strukturellen Thogrammen sind die Verbindlichkeiten für Dauer⁶ähnlich hoch (Pearsons R² > 0,90). Frequenz- und Latenzmaßnahmen erfordern geschulte Beobachter, während Die Dauermaßnahmen weniger beobachterabhängig und daher in den Laboratorien zuverlässiger sind³⁰.

Die Zuverlässigkeit innerhalb eines Labors und die Wiederholbarkeit in Laboratorien hängen von Methoden ab. In unserem Labor, das Videosystem kontinuierlich aufgezeichnet, die Dateien wurden zunächst als 5-Minuten-Dateien gespeichert, und einige HAT-Sitzungen traten über zwei Dateien. Weniger Fehler wurden gemacht, wenn die genaue Zeit aus dem Datenblatt verwendet wurde, um die Videos zu beschneiden und zu kombinieren. Vor der Entwicklung des Ethogramms durften Beobachter das Videomaterial anhalten, anhalten und zurückspulen, um alle Verhaltensweisen im gesamten Ethogramm zeitgemäß zu machen. Diese Methode verursachte nicht nur Variationen in der Zeitstempelung jeder Probe, die von 3 min bis 20 min reichte, sondern die Zuverlässigkeit zwischen und innerhalb des Beobachters war auch für die meisten Verhaltensweisen schlecht. Daher haben wir die Wiedergabegeschwindigkeit eingestellt und beobachter hatten Zeitstempel jeder Kategorie zu einem Zeitpunkt. Wenn die Zuverlässigkeit in nur einer Kategorie gering war, haben Beobachter daher unabhängig voneinander nur die Kategorie und nicht das gesamte Ethogramm neu eingeprägt, nachdem sie die Definitionen und das Filmmaterial zusammen konsultiert hatten. Die Set-Wiedergabe- und Kategoriemethoden ermöglichten eine konsistente Vorhersage, wie viel Zeit benötigt wurde, um die einzelnen Stichproben zeitstempeln zu können. Bei Projekten, die länger als einen Monat dauern, ist die routinemäßige Überprüfung der codierten Videos und die Zuverlässigkeit innerhalb des Beobachters wichtig zu messen.

Ein weiterer Faktor, der die Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit reduziert, ist die Videoeinrichtung. Zunächst wurden eine Handkamera und ein Stativ verwendet, die von Stift zu Stift verschoben wurden. Bei der Verwendung dieser Methode mussten die Schweine vor dem HAT in das Stativ und die Kamera eingeführt werden; Andernfalls schienen die Schweine mehr auf das Stativ und die Bewegung als auf den Testmenschen zu reagieren. Darüber hinaus beschränkten Nicht-Overhead-Kamerawinkel die Sicht des Betrachters während der Zeitstempelung und die Tiefenwahrnehmung des Raumes erhöhte die Innerhalb- und Zwischen-Beobachter-Variation in den räumlichen Verhaltensmaßnahmen; Deshalb haben wir das Protokoll mit festen Kameras entwickelt. Wenn diese Methode verwendet wird, ist zusätzliche Sorgfalt erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kamera vor jedem Test korrekt platziert wird, und es wird mehr Zeit für die Einrichtung zwischen den einzelnen Schweinesitzungen benötigt. Wir erfuhren jedoch, dass das kontinuierliche Video-Overhead-System seine Erstaufnahme um Mitternacht mindestens 24 H vor dem ersten HAT starten musste. Die Zeitstempelanzeige für viele Videosysteme ist nicht genau und wird bis zum Frame synchronisiert. Daher verlassen wir uns nicht mehr auf die Anzeigezeiten. Die Mitternachtsstarts sind für die exakte Frame-Capturing und Videobearbeitung zulässig, und die Zeitstempelanzeige wurde nicht verwendet.

Darüber hinaus war die Akklimatisierung der Schweine und das Einrichten einer Routine bei der Fehlerbehebung dieses Tests wichtig. In Aufnahmen von Schweinen, die nicht gut an ihre Umgebung akklimatisiert waren, wurde während des HAT Tempo beobachtet. Dies ist ein Indikator dafür, dass sich das Schwein in einem aufgeregten Zustand³¹ und nicht in einem Sondierungszustand^{befindet 32}. Akklimatisierungszeiträume von drei oder mehr Wochen können die Anzahl der Schweine, die in einem Experiment Tempo. Wenn jedoch das Tempo während aller Probenahmeperioden anhält, muss dieses Ethogramm möglicherweise angepasst werden, um Spaziergänge und Stillstand einzuschließen.

Gültigkeit ist der Umfang, in dem eine Messung den beabsichtigten Umfang der gestellten Frage darstellt²⁵. Bei der ersten Entwicklung des HAT haben wir nur ein räumliches Ethogramm verwendet. Definitionen des räumlichen Ethogrammverhaltens beschreiben genau und spezifisch die Nähe zu den menschlichen Subjekten und sie sagen dem Betrachter direkt, wie viel Raum das Schwein zwischen sich und einem Menschen hinterlässt. Sobald diese Methoden jedoch auf eine neue Laboreinrichtung angewendet werden müssen, erkannten wir, dass räumliche Ethogramme laborspezifisch sind. Stiftbemaßungen und die Platzierung anderer Objekte beeinflussen das Ergebnis des räumlichen Ethogramms; Daher muss ein Diagramm mit Messungen und Besonderheiten des Stifts veröffentlicht werden, wenn die Stifteinrichtung nicht zuvor gemeldet wurde. Zusätzlich zur Berichterstattung über die Stiftumgebung wurden die strukturellen Verhaltensweisen dem Ethogramm hinzugefügt. Im Gegensatz zu räumlichen Verhaltensweisen können strukturelle Verhaltensweisen in Laboratorien leichter ausgewertet werden; Diese Verhaltensweisen haben Gültigkeit, weil sie speziell den aktiven Zustand des Schweins beschreiben. Wenn ein Schwein ruht, ist es wahrscheinlich nicht motiviert, sich zu nähern und ist nicht in der Lage, Positionen zu ändern, um so schnell wie ein stehendes Schwein zu nähern. In ähnlicher Weise befindet sich ein Schwein mit NNOB in einem explorativen Zustand, aber ein Schwein mit dem Kopf noch im Stehen ist wahrscheinlicher in einem katatonischen Zustand. Die Nasenausrichtung hilft mit Gültigkeit, weil die Nase, Ohren, und dann Augen sind, was das Schwein verwendet, um Informationen über den Menschen zu sammeln.

Einschränkungen der Technik:

Ein potenzielles Problem bei dieser Technik ist die Variabilität der Reaktionen der Schweine auf den Testmenschen. Darüber hinaus werden Schweine auf die Hände des Testmenschen schauen, was zu unbeabsichtigten Hinweisen durch diese Person führen kann. Daher wurden diese Einschränkungen durch die experimentelleN Prüfung von 1) den Reaktionen der Schweine auf einen vertrauten Menschen und unbekannten Menschen ausgedrückt, und 2) standardisiert, dass, nachdem das Pellet fallen gelassen wurde, der Testmensch stillsteht und seine Hände aus dem Schweinssicht. Die Daten zeigten, dass es während des HAT (Tabelle 2) keine Behandlung oder Behandlung x Zeitunterschiede gab, was darauf hindeutet, dass der HAT entweder von vertrauten oder unbekannten Menschen verabreicht werden könnte. Andere Forscher deuten darauf hin, dass Schweine dazu neigen, über den Menschen basierend auf früheren Wechselwirkungen zu verallgemeinern^11,12,13; Daher müssen die bisherigen Erfahrungen eines Schweins mit Menschen positiv sein. Diese Herausforderung kann auch mit einem wachsamen experimentellen Design behoben werden; für jeden Block ist eine ausreichende Anzahl von Versuchseinheiten erforderlich, die für jede Behandlung von Interesse vertreten sind.

In dieser Studie gab es zwar nur zwei erfahrene Beobachter, die alle Videos für alle drei Gehäusetypen zeitstempelten, es gab jedoch Unterschiede zwischen den Gehäusetypen für spezifische Verhaltensergebnisse (Tabelle 1). So gelangten beispielsweise Schweine im Wohntyp B häufiger in den nächstgelegenen Bereich als Schweine der Wohntypen A und C. Dies ist wahrscheinlich auf einen Unterschied im Stiftmaterial zurückzuführen; im Gehäuse Typ B war die Vorderseite des Stiftes ein kettengebundenes Tor mit horizontalen Balken, das es dem Schwein ermöglichte, das Tor während des HAT zu erklimmen. Die Wohntypen A und C hingegen hatten vertikale Balken und weniger horizontale Flächen, auf die die Schweine klettern mussten. Diese Variabilität kann behoben werden, indem die Dauer der Ausgaben in den nahen und nächsten Bereichen addiert wird, bevor sie zwischen den Wohnungstypen verglichen werden (Tabelle1; P > 0,10). Schweine im Wohnungsbautyp C verbrachten jedoch mehr Zeit in der Ferne als schweinearten A und B (Tabelle1; P < 0.05), was wahrscheinlich auf die Platzierung von Wasserern in der Rückseite des Stifts und nicht an der Vorderseite des Stifts zurückzuführen war. Dies ist eine Einschränkung, die behoben werden kann, wenn Laboratorien sich entscheiden, die Platzierung von Wasserlern, Schalen und Spielzeug zu standardisieren und sicherzustellen, dass sie fixiert sind, damit das Schwein das Objekt nicht in einen anderen Bereich bewegt.

Dieser Test bietet eine hervorragende Zugänglichkeit für Laboratorien aller Art, aber, wie bereits erwähnt, werden das manuell gestempelte räumliche Ethogramm und die Messungen von Labor zu Laboratorien mehr variieren. Dennoch sind die körper- und kopfstrukturellen Ethogramme allgegenwärtig. Laboratorien, die Zugang zu validierten, automatisierten Tracking für Schweine haben, können davon profitieren, dass das räumliche Ethogramm automatisch und nicht manuell nachverfolgt wird, da die zurückgelegte Entfernung und die Bewegungsgeschwindigkeit zusätzliche Ergebnisse von Verhaltensmaßnahmen von die HAT. Die Einschränkungen durch die Einrichtung von In-Pen- und traditionellen Technologien anstelle von Testbereichen und automatischen Tracking-Technologien können durch die Anpassung der KI-Formel behoben werden. Die KI bietet standardisierte Messungen und Terminologie, wie einzelne Schweine ihren Gehegeraum nutzen und Interesse an einem Menschen zum Ausdruck bringen. Diese Berechnung, abgeleitet aus allgemeinen Verhaltensmessungen, ist empfindlich gegenüber Schweinemodellen von subkonkussivem mTBI und möglicherweise anderen Zuständen subklinischer Verletzungen oder Krankheiten. Darüber hinaus reduziert die KI zufällige Variationen während der Experimente und kann leichter in Experimenten und Laboratorien verglichen werden als Methoden, die auf experimentierfreudigere Messungen angewiesen sind. Die strukturellen Verhaltensweisen lieferten die Grundlage für diese Formel, da es sich bei diesen Verhaltensweisen um Standardmessungen zwischen Behandlungen handelt, während das räumliche Verhalten von der Stifteinrichtung, der Anzahl der Schweine in einem Stift und dem Tracking-System abhängt. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass, wenn zwei gesunde Schweine in einem Stift getestet werden, sie ähnliche räumliche Verhaltensweisen ausführen, indem sie sich zusammen nähern, aber das Schwein, das dem ersten folgt, kann seine Nase mehr an seinem Federpaar als an seinem menschlichen orientieren und mehr NNOB ausdrücken. , weil das Schwein, das führt, als Wächter dient. Nichtsdestotrotz hilft die KI, diese Variation auch von gepaarten Verhaltensweisen zu reduzieren.

Obwohl die KI ein ausgezeichnetes Toolset für die Standardisierung des Tests in Laboratorien ist, möchten Forscher möglicherweise dennoch testspezifische Verhaltensergebnisse innerhalb eines Labors oder Experiments untersuchen, insbesondere wenn sie über genügend Leistung verfügen (d. h. experimentelle Einheiten und wiederholte Tests) in einem einzigen Experiment. Daher wurde hier Tabelle 1mit allen Verhaltensergebnissen, der Varianz, der Verteilung und einem berechneten Test für die Anzahl der Tiere für jedes spezifische Verhalten enthalten. Wenn Forscher beispielsweise Stiftumgebungen haben, die es Schweinen ermöglichen, während des HAT konsequent zu klettern, und sie wissen, dass ihre Behandlung über einen Unterschied von 75 % im Kletterverhalten verursacht, dann können sie Tierzahlen basierend auf der gemessenen Varianz rechtfertigen. Wenn dem Ethogramm neue Verhaltensweisen hinzugefügt werden, müssen Wissenschaftler begründen, welche Verhaltensweisen auf Ansatz oder Rückzug hindeuten, bevor sie in den Index aufgenommen werden. Wenn z. B. die meisten Tiere innerhalb eines Versuchstempos entlang der Wände des Pens (d. h. thigmotaxis)³², könnte die Dauer dieses Verhaltens in die körperstrukturelle Ethogrammkategorie integriert werden. Das Verhalten kann im detaillierten gestapelten Balkendiagramm (d. h. Abbildung 5) oder in der Tabellarische Form dargestellt werden, und dann kann es mit Stand-Still zusammengefasst werden, bevor die Indexberechnung angewendet wird. Die KI kann daher Verhaltensweisen darstellen, die in Laboratorien allgegenwärtig sind, aber zusätzliche einzigartige Verhaltensweisen können weiterhin separat dargestellt werden.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:

Die bestehenden Methoden für den HAT wurden für Schweine in kommerziellen Betrieben zur Bewertung des Tierschutzes eingeführt. Hier wurde ein Protokoll für Laborschweine erstellt, das Forschern helfen kann, den Tierschutz zu bewerten und mTBI-Schweine von scheinbehandelten Schweinen zu unterscheiden. Ein alternativer traditioneller Test könnte die Verwendung eines Open-Field-Tests sein. Dieser Test wurde zuvor verwendet, um Schweineemotionalität und Wohlbefinden zu bewerten³³. Freifeldtests wurden ursprünglich entwickelt, um die affektiven Zustände von Nagetieren zu testen, indem sie ihre natürliche Abneigung gegen freiwerdenden Raum und Licht messen. Im Gegensatz dazu können gesunde Schweine die gleichen Reize wie appetitive¹⁰sehen, und nach einer Krankheit, Verletzung oder Stressbehandlung drücken sie wahrscheinlich Angst aus. Dieser Test erfordert mehr Laborfläche und erfordert, dass sich Schweine akklimatisieren, um behandelt und in eine Offene-Feld-Arena gebracht zu werden. Wenn Laboratorien über Platz verfügen und Protokolle für den Umgang mit den Schweinen vorhanden sind, können wiederholte HAT-Sitzungen zusätzlich zu einem Großfeldtest dazu beitragen, behandelte Tiere weiter von scheinbehandelten Tieren zu unterscheiden.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls:

Die ersten drei Schritte im Protokoll sind die wichtigsten für erfolgreiche HAT-Maßnahmen. Die Sitzungen pro Schwein dauern nur 3 min; Eine angemessene Vorbereitung wird jedoch dazu beitragen, diesen Test zuverlässig zu machen. Wie oben erwähnt, ist der Kamerastandort und die Aufnahmeeinrichtung entscheidend für Klarheit und Replikation. Unsachgemäße Kamerawinkel können die Sicht des Betrachters einschränken, wodurch fehlerbehaftete Messungen auftreten. Ein weiterer oft übersehener Schritt ist das Fixieren der Objekte im Stift. Das Schwein bewegt unfixierte Objekte, und dies kann seine Motivation beeinflussen, sich dem Menschen zu nähern. Das Einrichtungs- und Verwaltungssystem ist wichtig, da Schweine an ihre Umgebung angekklimatisiert werden müssen, bevor sie den Test konsistent durchführen können. Schweine, die nicht gut an ihre Hausstifte oder Routinen gebunden sind oder Stress haben, werden sich in anderen Bereichen und nicht auf der Rückseite des Stifts³⁴vermehren. Der Defäkationsbereich kann sich auf ihre Motivation auswirken, sich anzunähern. Aus der Kamerasicht sollte der Beobachter in der Lage sein, einzelne Schweine zu identifizieren; es ist jedoch wichtig, dass das Kennzeichnungssystem keine Informationen über die Behandlung des Tieres liefert, da dies den Beobachter²⁵verzerrt.

Die Identifizierung von Schweinen ist sehr wichtig, um die richtigen Verhaltensdaten für das richtige Schwein zu erhalten, auch wenn sie eingeschossig sind. Schweine werden oft für ihre Behandlungen bewegt, und eine Markierung versichert dem Betrachter, dass sie das gleiche Schwein beobachten, nachdem es entfernt und wieder in seinen Stift gelegt wurde. Schweine können paarweise untergebracht werden, wie in Derenkleben Typ C, und daher wird es sehr wichtig, die Schweine zu identifizieren. Viehmarkierungfarben und Markierungen erfordern tägliche Anwendung; Daher erfordert dieses Protokoll die Verwendung eines medizinischen Klebebandes und eines Abstrichs von TagZement. Das Band klebt am besten an Schweinen mit längeren Haaren. Schweine mit kurzen Haaren und trockener Haut werden das Band häufiger abschleppen als Schweine mit längeren Haaren.

Zukünftige Anwendungen:

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene nichtinvasive IN-Pen-HAT-Test empfindlich genug ist, um leichte und zeitlich abhängige Veränderungen bei Schweinen nach mTBI zu erkennen. Darüber hinaus haben wir einen gewichteten Index namens KI entwickelt, um Veränderungen bei Schweinen, die in verschiedenen Stalltypen sowie in verschiedenen Schweinearten untergebracht sind, zu bewerten. Obwohl der HAT verwendet wurde, um Veränderungen bei Schweinen zu erkennen, die mTBI ausgesetzt sind, kann dieser Verhaltenstest nützlich sein, um messbare Verhaltensänderungen bei Tieren mit Stress oder präpathologischen Bedingungen zu erkennen.