利用网格和收集荧光蛋白陶瓷的结构解

1 . 的表达和纯化 注: 这是以 Lelimousin 等人发布的协议为基础的.21 在大肠杆菌 Bl21 细胞中的快速 has 标记 Cerulean 细胞生长在37°c 的 4 L 的自动诱导培养基 23, 直到 OD 600= 1, 然后在27°c 孵育过夜。 以 5, 000 x克的速度采集细菌细胞,并通过超声 (40%、5分钟、10秒脉冲、10s 暂停) 在由 20 Mm tris ph 8.0、500 mm nacl 和 1x edtal 蛋白酶抑制剂组成的 200 ml 缓冲液中裂解细胞。 在相同的缓冲条件下 , 用 100 mM 咪唑将上清液装上 hs 陷阱 ni – nta 柱和。 池明亮的黄色分数。蛋白质具有固有的颜色, 因此含有硒的组分很容易区分。 在 20 mM Tris ph 8.0 中的 S75 柱上纯化蛋白质 (4 毫升)。 将明亮的黄色组分集中, 将蛋白质溶液集中到 15 mg/mL。 2. 结晶 在 Linbro 板中使用 20°c时的悬挂滴蒸气扩散技术24。在 pH 值6.75、12% PEG8000 和 100 mM MGCL 2 处, 用 100 mm hepes 组成的 100 Mm Hepes 在井中灌满1毫升的沉淀液.对于悬浮液, 将浓缩为15mgml 的1μl 蛋白质与1μl 的沉淀液混合。晶体应出现在24小时内。 收获所获得的晶体, 并将其转移到由 0.1 m HEPES pH 6.75、22% PEG 8000 组成的种子缓冲液的100μl 中。 用 0.1 mL 的组织磨床研磨晶体, 并在种子缓冲液中稀释 (比例 1:100)。 用胰蛋白酶 (同一缓冲液中的 0.5 Mg/ml) 消化蛋白质库存溶液的一个 (1:10 (v/v))。 将消化后的蛋白质溶液与10% 的含种子缓冲液 (v/v) 混合。 在 0.1 M HEPES ph 值 7, 14% peg8000, 0.1 mgcl 2 在1-1.5 μl 悬浮液中使用蒸汽扩散方法生长晶体 (10 * 10 * 20μm 3)。 3. 晶体安装 使用合适的环路,例如,一个700平方孔的网状环路, 每个孔25微米, 安装在 spine 标准样品支架25上。将结晶液从结晶液 (步骤 2.6) 转移到1Μl 的低温保护剂溶液中 (与甘油混合的井状沉淀液 (20% v/v 最终))。 通过移动晶体下的循环并将其从滴下抬出, 将蛋白质晶体浆料安装到网格环路上。理想情况下, 晶体的最大尺寸应在5μm–30μm 的尺寸范围内, 而不存在安装在环路中的晶体之间的重叠。 用滤纸快速触摸安装, 将多余的液体擦掉。沉积晶体, 使他们坐在平面的循环包围尽可能少的散装液体。 将安装到充满液氮的单盘中。将皮球以 100 K 的价格存放在合适的存储容器中, 直到光束时间可用。 4. 同步加速器实验的离线准备 注意: 尽早请求同步加速器光束时间, 并遵循可用访问类型和如何提交给定同步加速器申请的在线指南。ESRF 指南可在 http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying 找到。如果是 ESRF 块分配组 (BAG) 的成员, 则不需要每个特定项目的应用程序。在这种情况下, 实验者应该接近他们的袋子负责调度梁的时间。 在建议被接受并收到实验邀请后, 让所有参与者完成安全培训。在 “a 表单” (通过ESRF 用户门户, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) 中填写样品所需的安全信息。请联系当地联系人讨论实验。一旦您的 a 表单提交并验证, 它将为您提供实验编号和密码。 连接到扩展的 ISPyB26 (http://www.esrf.fr/), 然后选择mx。 使用实验编号和 a 窗体中的密码登录。 选择货件添加 “新建”并填写所需信息。 选择”添加包裹”并填写相关数据。选择”添加容器”, 选择一个非 ipuck 并填写所需的信息, 包括样品持有人在 puck 中的位置。 5. 将样品加载到波束线上 在实验哈奇中, 将皮球加载到样品转换器 (SC) 中, 并记下其位置。 互锁实验舱, 进入控制室。 登录到 ISPyB (https://esrf.fr/)。选择 “准备实验”, 查找装运, 选择”下一步” , 并指示供应链中的波束线和皮球位置。 登录到波束线控制软件, 这里的 mxcube227,28与实验编号和密码提供的 a 表。 按同步可将波束线控制软件与 ISPyB 数据库同步。 使用波束线控制软件, 将样品支架安装在测角仪上。在 MXCuBE2 中, 右键单击样品转换器区域中的某个位置, 然后选择”安装示例”。 利用大多数 ESRF mx 波束线上安装的 MK3 微型 kappa 测角仪29 , 使用 mxcube2 的 “视觉重新调整” 工作流程30将样品支架的平面与测角仪的旋转轴对齐。 选择 “中心” 按钮, 然后在循环尖端边缘的中间选择3点点击中心。通过选择”保存”保存居中位置。 再次单击 “中心” 按钮, 然后在循环的茎开始中间单击中心。通过单击”保存”来保存第二个位置。 通过单击它选择保存的居中位置之一。 在”高级” 下, 将工作流视觉重定向添加到 mxcube2 数据收集队列中。 通过单击”收集队列” 启动工作流。 工作流将样品夹持器的平面与测角仪的旋转轴对齐后, 再次居中样品夹持器, 这次是在网格中间的某个位置。 通过使用 MXCuBE2 旋转欧米茄轴, 将样品支架定向, 使网格的表面与 x 射线光束方向垂直。 在 MXCuBE2 中, 选择扫描样品支架所需的光束大小 (仅适用于具有可变光束大小的波束线)。 单击波束线控制软件中的光圈下拉菜单, 然后选择一个值,例如10μm。 定义网格扫描的网格。 单击 MXCuBE2 中的网格工具图标。将出现网格工具窗口。 在 MXCuBE2 的示例视图中, 通过左键单击并将鼠标拖到样品支架上包含晶体的区域上绘制网格。 要保存网格, 请单击网格工具窗口中的加号按钮 (网格变为绿色)。 6. 准备和执行网格和收集工作流程 在 MXCuBE2 的分辨率字段中, 输入应收集衍射图像的分辨率 (dmin),例如,此处为1.8。 在 “高级数据收集” 选项卡中选择”网格和收集”, 将其添加到队列中, 然后单击 “收集 队列”。 在出现的参数窗口中, 使用与波束相关的默认参数。在这里描述的实验中, 默认参数是每个网格扫描点的曝光时间 0.037 s, 100% 传输 (在这种情况下导致 4 x 1011 phps), 每个网格扫描线1°振荡。 单击 ” continue”。利用 DOZOR 软件 1, 根据衍射强度对每个栅格点上采集的网格扫描运行和衍射图像进行分析和排序。此过程在后台运行。 在继 DOZOR 分析之后, 将生成热图, 并根据衍射强度自动分配后续部分数据收集的顺序 (参见图 1)。注意: 此步骤的结果也可以在 ISPyB 中进行检查。对于部分数据集的收集, 在波束线控制软件中弹出一个设置的新选项卡, 选择旋转范围 (即0.1°)、图像数量 (即100)、曝光时间、分辨率、传输、理想情况下, 收集的每个楔形的剂量应低于 garman 极限 (30 mgey)。在所述实验条件下, 每张图像的大约曝光时间为 0.37 s 到0.1秒。 单击 “继续” 启动部分数据集合。 7. 数据处理 注意: 部分数据集集成了一个合适的程序 (XDS10)。为此, 将使用 Python 脚本来识别每个单独的数据集, 对其进行集成, 并确保不同部分数据集之间的索引是一致的。 打开包含图像的文件夹:/data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean。 制作可在收集部分数据集的文件夹中找到的进程子文件夹的安全副本。 在 Linux 终端上, 使用命令cp–r 进程 _ 备份。 导航到进程文件夹并启动处理脚本。 在 Linux 终端上, 键入命令cd 进程并命中输入。 键入Procmultycydata 并命中输入。注意: 脚本将要求空间组和单元格参数 (此信息是可选的), 根据说明输入这些参数。在最后一次用户确认后, 脚本将自动运行。 8. 数据集的合并 注意: 在所有部分数据集集成后, 将它们的最佳组合合并, 以生成用于结构确定和细化的最终数据集。这个合并过程的不同的目标可以是获得充分的完整性 (强烈推荐)、高多样性或最佳的数据统计 (高 、低 r 因素等)。后者有时可能以牺牲完整性和多样性为代价, 因此应谨慎选择这一选择。 使用程序 ccCluster14合并部分数据集。它使用分层聚类分析 (HCA) 来确定同构部分数据集 () 的可能组合。 在 Unix 终端中键入CcCluster集, 以打开其图形用户界面 (gui)。注意: 在 ccCluster GUI 中绘制了一个树状图。这就提出了一个建议, 即哪些部分数据集可能是基于它们之间的同构而最好合并的。 单击与垂直轴上的值约0.4 相对应的节点。通常, 较高的值将包括更多的部分数据集, 但导致合并统计信息越差, 因为部分数据集的同构程度会降低。 点击市场数据。选定的群集将在后台处理, 估计的合并统计信息将显示在 GUI 中的新选项卡中。对于不同的数据集组合, 可以重复此步骤。对于部分数据集的良好组合, 完整性应接近 100%, 值高 (在最低分辨率外壳中为10或更高), r-meas31值较低 (在低分辨率外壳中约为 5%)。 对于所选的每个组合, 使用生成的输入脚本将所选的部分数据集合并到单个 mtz 文件中 (即无意义的 32)。 使用缩放程序 (即漫无目的 32) 明确缩放和合并此文件中的强度数据,与源自单晶数据收集的文件一样, 使用输出进行后续阶段阶段和结构解决方案33.