Roman Objectherkenning en Object locatie gedrags testen in muizen op een begroting

Dit protocol biedt een voordelige methode om uit te voeren van de locatie van het object en roman Objectherkenning gedrags testen in muizen. Deze tests kunnen de evaluatie van zowel de hippocampal functie als de functie van andere corticale gebieden, zoals de prefrontale cortex, die betrokken zijn bij object erkenning¹⁰. De OLT en NORT hebben het voordeel van het vermijden van prikkels met sterke emotionele valence die vereist voor de Morris water maze, contextuele vreesconditionering, Barnes doolhof of radiale arm doolhof zijn. Ze voorkomen ook de behoefte aan voedsel ontbering als vereist voor de radiale arm doolhof. Bovendien, dit protocol behelst een eenvoudige twee-daagse test procedure die geen uitgebreide of ingewikkelde apparatuur voor uitvoering of analyse vereist. Een nadeel van deze taken is dat ze niet toestaan voor maatregelen van leren of verwerving. Een verschil in nieuwheid onderzoek kon te wijten zijn aan armere leren over objecten tijdens opleiding, armere geheugen voor wat werd geleerd of beide. Totale tijd doorgebracht objecten onderzoeken is een belangrijke maatregel voor uitgesloten eventuele inherente verschillen in exploratie station maar is niet een maatregel van leren. Als maatregelen van leren belangrijk voor een experimentele vraag zijn, zou een water doolhof, Barnes doolhof of radiale arm doolhof waarschijnlijk beter zijn.

Aangepaste gebouw van gedrags arenas heeft het potentieel om te slaan honderden dollars en object testen binnen het financiële bereik van een breed scala aan labs. Dit protocol elimineert veel obstakels en stroomlijnt het proces van fabricage in-house arena bouw beter toegankelijk te maken voor wetenschappers met geen gespecialiseerde opleiding in acryl. Het is belangrijk op te merken dat aanschaf van gekleurde acrylplaten die met de muizen, zoals witte acryl voor zwarte muizen en zwart acryl voor witte muizen contrasteren zullen, vergemakkelijkt data-acquisitie en analyse, met name bij het gebruik van verkrijgbare de software van de analyse. Bestellen op maat gesneden vellen met “gerouteerd randen” elimineert de noodzaak voor een tabel (tabel 1) zag, en het gebruik van acryl cement elimineert de noodzaak om te boren en verzinkboor pilot gaten. Schroeven in de bevestigingsmiddelen, boren en snijden acryl vaak veroorzaakt pauze, chip en spleet vanwege het broze karakter. Omdat het cement is een oplosmiddel, het zal stromen naar het gebied wordt toegetreden, ontbinding en verzachten van een acryl wordt aangetroffen. Dus moet het niet worden toegepast op elk stuk afzonderlijk, alsof het een traditionele lijm. In tegenstelling tot lijm, zal het cement vullen negatieve ruimten of niet houden aan oppervlakken. Dit is de voornaamste reden om “gerouteerde randen” zoals dit voor een gladde en vlakke rand zorgen zal, creëren van een veel beter band. Wanneer de cement droogt, zal het de twee acrylplaten hebben gesmolten in een enkel stuk in een proces genaamd “oplosmiddel lassen”. Net als metalen lassen, het eindproduct is een enkel stuk, maar de gelaste gebied blijft altijd de zwakste locatie. Als zodanig, zodra de arena’s gebruikt worden, moet zorg worden genomen om te voorkomen dat de directe impact of extreme stress op die momenten.

Dit protocol laat ook zien hoe u 4 arenas voor gelijktijdige testen van tot 4 muizen (Figuur 1 en Figuur 2). De ondoorzichtige muren van de arena’s beletten dat muizen elkaar ziet tijdens de test, maar er is nog een mogelijkheid dat het hebben van andere muizen in de kamer geur veroorzaakt of lawaai afleiding die afbreuk kunnen doen aan de testen. Gewenning proeven als gedetailleerde hier kan helpen verzachten deze zorg, zoals muizen zijn blootgesteld aan de voorwaarden van de multi dierlijke kamer voordat gedrags test. Echter, als afleiding van andere muizen of experimentator ruis in verband met de behandeling van andere muizen bestaat grote bezorgdheid, een arena met één muisklik kan worden gebruikt, alsmede, hoewel het de benodigde tijd voor het voltooien van de OLT en NORT met meerdere muizen zal toenemen. Meer dan 4 arenas theoretisch ook gebruikt kunnen worden, maar de meeste camera’s hebben niet een breed genoeg gezichtsveld te tonen dat veel arena’s met goede resolutie.

De afmetingen en de afstanden die hier vindt u algemene richtlijnen voor het muis gedrags testen in een typische testen kamer die is 16 x 16 x 16 m³ in dimensies (figuur 1B en 1 C). Het instellen van passende milieu signalen, moet arenas, en video opname-apparatuur worden geoptimaliseerd voor elke omgeving. Signalen kunnen bestaan uit grote vormen of patronen (meestal in zwart-wit), waarmee muizen aan ruimtelijk oriënteren zich tijdens de OLT. In plaats van signalen op verschillende locaties tegenover elkaar plaatsen, kunnen signalen ook worden gemonteerd aan de muren van het testen gebied. Dit protocol adviseert de test kamer met een gordijn te verbergen van de onderzoeker en de computer tijdens het testen van de gedragsmatige verdelen. Tijdens alle gewenning, Inter proef intervallen en actieve proeven, moeten onderzoekers het gordijn te scheiden zelf uit de testen gebied sluiten. Indien dit niet praktisch, de computer kan blijven met het oog op de muizen, maar de onderzoeker moet verplaatsen uit het zicht tijdens de taak. Als de onderzoeker aanwezig is, proberen de muizen te vertrouwen op haar of hem als een ruimtelijke cue.

Alle gedrags tests moet worden ingevuld in een omgeving van temperatuur en vochtigheid-gestuurde met dim, maar zelfs verlichting op ongeveer 310 lux en minimale vreemde geluids- of sterke milieu geur signalen, zoals parfums op onderzoekers. Tussen elke dag proef en test moeten alle arena’s en objecten worden gereinigd met dier faciliteit aanbevolen methoden van sterilisatie zoals afvegen met 70% ethanol of ongeparfumeerde bleekmiddel veegt te minimaliseren olfactorische signalen. Als chemische ontsmettingsmiddelen worden gebruikt, wordt een laatste spoeling met 70% ethanol wordt aanbevolen omdat vele chemische ontsmettingsmiddelen kan irriterend voor de voeten van de dieren.  Zoals met elke gedrags taak, behandeling van muizen gedurende een aantal dagen voordat het testen is noodzakelijk om hen vertrouwd te maken met de personen die gaan uitvoeren de OLT en NORT en vermindering van stress tijdens het testen van^20,22. Zoals muizen acute stress als gevolg van onbekende personen in de nabijheid van het testen gebied ervaren kunnen, is het ook aanbevolen dat alle gedrags tests moet worden ingevuld door de dezelfde bekomen. Het testen parameters en de in dit protocol vastgestelde voorwaarden zijn geoptimaliseerd voor 6 tot 9 weken oude volwassen C57Bl/6 muizen en zou onthullen geheugen afwaarderingen als gevolg van schade in deze leeftijdsgroep de nuttigste of geheugen waardeverminderingen wegens leeftijd zelf in oudere muizen. Als het doel is om te testen voor de verbetering van het geheugen bij jonge muizen, zou een langere ITI variërend van 1 uur tot 1 dag passender om te voorkomen dat plafond effect op prestaties in de gemakkelijker 20 min ITI versie. Inderdaad, ITIs kunnen variëren van 5 min (voor onmiddellijk rappel) tot enkele uren of dagen (voor externe geheugens), afhankelijk van de specifieke behoeften van het experiment en de stammen en leeftijden van de muizen. Nog belangrijker is, ongeacht de lengte, moeten alle ITIs verenigbaar zijn tussen de sessies in een experiment. Zoals verschillende soorten en leeftijden van muizen verschillen in gedrag en leren vertonen, de timing voor elke proef en elk interval, gebied regeling, testen en objecten die worden gebruikt kunnen worden gewijzigd volgens de bepaalde spanning van muizen, hun leeftijd, en de specifieke schade / ziekte/interventie model geteste^9,21,23,25.

Terwijl de hippocampal afhankelijkheid van de functies van het ruimtelijke geheugen getest de OLT zijn reeds lang gevestigde, de NORT kan of niet kan beroepen op de hippocampus. Interpretatie van gegevens uit de NORT moet deelnemen aan deze waarschuwing aan account. De bepalende variabelen, of de hippocampus is betrokken, in het object erkenning geheugen op nog niet eens zijn, maar eventueel ITI lengte of saliency van ruimtelijke signalen¹⁸. Met name het gepresenteerde protocol gebruikt ruimtelijke OLT voordat de NORT, die muizen naar het gebruik van hippocampal processen in de NORT kan vertekening. Het is dus belangrijk op te merken dat de order kan worden teruggedraaid, of elke taak onafhankelijk kan worden uitgevoerd afhankelijk van de onderzoekers vragen en behoeften.

Een selectie van objecten is een cruciaal aspect van zowel de OLT en de NORT^22,24. Ideale objecten zijn zwaar genoeg niet gemakkelijk kunnen worden verdreven door een muis en gemaakt van materialen, zoals glas of metaal, die een muis kan niet beschadigen door kauwen of krassen. Houten, schuim of zacht plastic objecten zijn niet geschikt als ze gemakkelijk worden vervormd en zijn moeilijk om geur-vrij te houden. Bovendien, de objecten die worden gebruikt bij de proeven moeten relatief vergelijkbaar in grootte, textuur, geur en materiaal. Figuur 1 d geeft een voorbeeld van een geschikt object dat kan worden gebruikt. Dit Oranje kunststof beeldje van een kuiken is gevuld met zand te geven genoeg gewicht en verzegeld om te voorkomen lekkage van het schoonmaken van de reagentia of andere geur-veroorzakende agentia. Vanwege de vorm van de top zijn muizen niet in staat te klimmen op de top van of zitten op dit object. Dit object is voor de OLT of NORT, beste gekoppeld aan een ander object van vergelijkbare grootte, gewicht, materiaal, kleur en complexiteit, zoals een vergelijkbare kunststof beeldje van een konijn. Om ervoor te zorgen dat object onderzoek echt weerspiegelt voorkeur voor nieuwheid, alle objecten moeten worden gevalideerd voor gelijkwaardige intrinsieke waarde met een minimum van 8 muizen in dezelfde stam, geslacht en leeftijd van de experimentele groep als beschreven in punt 2.9 van het protocol. Bovendien moeten de objecten worden gerandomiseerde in termen van welk object is de roman of verplaatste object tussen muizen in dezelfde studie verder te verzekeren dat de inherente kenmerken van de objecten niet van invloed zijn op de voorkeur. Plaatsing van het object kan ook grote invloed hebben op het succes of de mislukking van de OLT en NORT. Objecten moeten worden Ophaalbare in de arena’s en niet te dicht bij de muren. Een hoek druk door een object is een aantrekkelijke plaats voor muizen te verbergen en dit zal verwarren onderzoeksmaatregelen.

Een belangrijke voorwaarde voor het verzamelen van gegevens is het definiëren van “actief onderzoek”, dat is wanneer een muis een object met haar neus wees op het object omgaat niet meer dan 2 cm afstand. Een muis bewegen over de bovenkant van het object of het kijken voorbij het object komt niet in aanmerking als actief onderzoek. Bovendien, omdat de OLT en NORT, is afhankelijk van een muis herinneren of de feitelijke kenmerken van het object de ruimtelijke locatie, moet er voldoende studie van deze tijdens de proeven van de opleiding. Zo moet de onderzoeker bepalen een minimale onderzoek tijd en uitsluiten van alle onderwerpen die niet voldoen aan dat niveau van de basislijn van onderzoek, traditioneel ingesteld op 20 seconden²¹.

Kwantificering van object onderzoek tijd kan worden bereikt op verschillende manieren met of zonder dure analysesoftware. Als handmatige scoren wordt gebruikt, zoals hier wordt beschreven, kan de meest uitgebreide verzameling van de gegevens worden bereikt door de tijdstempels op de video opnemen wanneer de muis is het onderzoeken van het object. De begin- en eindtijd opnametijden van object onderzoek tijdens de drie afzonderlijke proeven wordt gemaakt van een permanente log van onbevooroordeelde tijdstempels en vergemakkelijkt nauwkeurige handmatige berekening van gegevens in tegenstelling tot alternatieve methoden zoals het gebruik van een stopwatch om te addiditief de totale tijd die een muis elk object onderzoekt vastleggen.

Commerciële softwarepakketten zijn ook beschikbaar voor het object onderzoek scoren. Commercieel beschikbare software kan bieden een schat aan gegevens na de hand scoren gegevens hier beschreven, met inbegrip van de totale afstand reisde, hoeveelheid tijd doorgebracht in bepaalde gebieden van de arena, en snelheid van beweging^16,23. Software, eenmaal correct gekalibreerd en bevestigd aan betrouwbaar detecteren object onderzoek, de gegevens veel sneller dan handmatige scoren ook kan opleveren. Deze opbrengst gegevens sneller kan, op de lange termijn, netto besparingen ten opzichte van de mens-uren vereist voor het scoren van de handmatige opleveren. Echter de meeste softwarepakketten voor gedragsanalyse hebben hoge aanloopkosten die onbetaalbaar voor vele labs worden kunnen en handmatige scoren kan vaak worden bereikt door student-onderzoekers, maken de uurloonkosten gedrags scoren minimaal. Commerciële software komt ook vaak met beperkingen op hoeveel gebruikers toegang de software gelijktijdig tot kunnen, beperking van de gegevens doorvoer en tijd besparen. Hoewel er vele voordelen aan deze softwarepakketten, zijn ze niet noodzakelijk van tijd onderzoeken van voorwerpen uit de OLT en NORT essentiële informatie te verzamelen. De mogelijkheid om handmatig het verwerven van deze gegevens maakt nieuwe object taken meer financieel toegankelijk zijn voor een breder scala aan onderzoekers.

Een extra eigenschap van dit protocol is dat de eerste zitting van gewenning is in wezen een proef in een open veld, die gegevens over de activiteit en angst niveaus kan opleveren. Activiteitenniveaus kunnen worden gekwantificeerd aan de hand van de totale afgelegde afstand of gemiddelde snelheid, als het bijhouden van software beschikbaar is. Evenzo met tracking software, kunnen angst maatregelen worden afgeleid uit de tijd doorgebracht in het midden van de arena of afstand reisde in het midden. Deze gegevens kunnen ook handmatig worden verworven door de arena video te bedekken met een raster en kwantificeren van kruisingen. Deze open-veldgegevens kunt u uitsluiten dat bruto motor tekorten of overmatige angst die met object onderzoek later interfereren kan.

De statistische tests gebruikt in dit protocol zijn representatief voor de traditionele methoden voor analyse. Bij het vergelijken van 2 groepen van muizen, wordt een twee gepaarde steekproeven, tweezijdige t-test aangeraden om te testen de significantie van het verschil in percentage tijd onderzoek naar het verplaatste of Roman object tussen groepen. Als de omvang van de steekproeven ongelijk zijn, hebben uitzonderlijk hoge variabiliteit of Toon ongelijke variabiliteit tussen de groepen, dat een niet-parametrische test wordt aanbevolen in plaats daarvan, zoals veel van de onderliggende hypothesen voor de t-test in deze voorwaarden zullen worden geschonden. Bij het vergelijken van 3 of meer groepen van muizen, worden ANOVAs aanbevolen om te testen of groep heeft een significant effect op percentage tijd onderzoek naar het verplaatste of Roman-object. Fout-gecorrigeerd post-hoc tests, zoals de Tukey test of Bonferroni-gecorrigeerd paarsgewijze vergelijkingen, kan dan worden toegepast om te testen het verschil in percentage onderzoek tijd tussen elk paar van groepen. Met de OLT is een extra manier om gegevens te analyseren om te testen voor een significante verandering in het percentage tijd onderzoek naar het verplaatste object van opleiding naar OLT proeven. Met slechts één groep van muizen, deze test zou de vorm aannemen van een gekoppelde, tweezijdige t-test, testen van ingrijpende veranderingen in percentage tijd met het verplaatste object van opleiding naar OLT in elke muis (analyses in het achterhoofd dat dit zijn gekoppeld en niet onafhankelijk metingen, aangezien elke muis twee gegevenspunten levert). Met twee groepen muizen, een herhaalde maatregelen two-way ANOVA zou worden gebruikt, is met de herhaalde maatregel de berechting (opleiding versus OLT) en de groepsopdracht wordt de tweede factor. Post-hoc tests voor verschillen tussen behandelgroepen moeten vergelijken met de groepen aan elkaar binnen proeven.

Als alternatief, als bewijs van het geheugen in de OLT of NORT alles wat wordt getest is, kan een one-sample t-test van de percentage tijd onderzoeken van een object ten opzichte van de vaste waarde van 50% worden gebruikt. Een percentage tijd aanzienlijk hoger is dan 50% suggereert geheugen voor het object. Een percentage tijd aanzienlijk lager ligt dan 50% suggereert afkeer (voor sommige reden) en object keuzes moeten opnieuw worden beoordeeld. Echter, de one-sample t-test kan niet onthullen of twee of meer groepen van elkaar verschillen. Bijvoorbeeld, in een experiment met twee groepen van muizen, als groep A bezig geweest met 60% van de tijd met het nieuwe object voor p = 0.049 door one-sample t-test vergelijking met 50%, en groep B slechts 59% van de tijd met het nieuwe object uitgegeven voor p = 0.051 , Groep A verschilt aanzienlijk van 50% (en groep B is niet). Het is echter onjuist om te concluderen dat deze twee groepen van elkaar afwijkt zijn. Een twee-sample t-test vergelijken A en B kan gemakkelijk onthullen dat deze twee groepen statistisch niet te onderscheiden zijn. Als het einddoel is te vergelijken van de geheugenprestaties van twee of meer groepen, moeten die groepen statistisch worden vergeleken met elkaar, niet alleen ten opzichte van een externe norm. Een soortgelijke richtlijn geldt voor een vergelijking van de tijd doorgebracht met een verplaatst object tussen opleiding en OLT. In dit geval, toont het vinden van een significant verschil in percentage tijd met een verplaatst object tussen opleiding en OLT in één groep en niet in een ander niet dat deze groepen statistisch verschillend zijn. Groepen moet post-hoc vergeleken tegen elkaar binnen elk afzonderlijk experiment, niet alleen over proeven binnen de groep.

Het is belangrijk om in gedachten houden dat het onderzoek tijd voor elke individuele muis kan niet worden gebruikt als bewijs voor of tegen geheugen. Eerder, geheugen voor object locatie of identiteit bij deze taken kan slechts worden geconcludeerd op basis van statistische gegevens die door statistisch wordt vergeleken met de statistische gegevens van een andere groep of de vaste kans niveaus (50% voor tijd, 0 voor discriminatie verhouding). De grootte van de steekproef nodig zal sterk afhankelijk zijn van de grootte van het effect van een bepaalde manipulatie en variabiliteit in gedrag, allebei waarvan op zijn beurt zal afhangen van de muizen wordt gebruikt. Leeftijd, geslacht en manipulaties al invloed variabiliteit. In de voorbeeldgegevens gepresenteerd in figuur 3A en 3B, n = 14 onderwerpen werden gebruikt, levert een effect grootte van 0.68 en kracht van 0,65 voor een gepaarde t-toets met α = 0,05. Desgewenst een kracht van 0,8 waren voor deze vergelijking, kan de grootte van een steekproef van 18 zouden moeten zijn.

Deze discussie wordt omlijst rond p-waarden en betekenis cutoffs omdat deze de maatregelen en de analyses meestal zijn voor OLT en NORT gegevens gerapporteerd, en daarom dreigen te kennen zowel de onderzoekers en de revisoren. Deze afhankelijkheid van p-waarden is zwaar bekritiseerd als statistisch ongeldige²⁶. Echter, hoewel alternatieve analysemethoden bestaan en in sommige tijdschriften²⁷zijn goedgekeurd, geen hebben is in grote lijnen aangenomen door de gedrags- en biomedisch velden als standaard²⁶.

Kortom toetst dit protocol effectief geheugen in muizen tegen minimale kosten. Aanbevelingen voor passende wijzigingen in het protocol zijn opgenomen om te zorgen voor een succesvolle uitvoering met een kleine knaagdieren model. Toepassing van dit protocol op specifieke letsel of therapeutische interventie modellen kan onthullen waardevolle functionele relevantie die een aanvulling op de cellulaire en moleculaire mechanismen bestudeerd.