Pichia Pastoris 탈 억제 기술을 채용 하 여 메탄올 독립 식

1. 미디어 준비 버퍼링 된 최소한의 미디어 (글리세롤과 BMG, 탄소 소스로 포도 당과 BMD) 준비 (1 L) 증류수 1 L 나사 뚜껑 유리병에 650 mL 압력솥. 후 냉각, YNB (아미노산 / 134 g/L 효 질소 기초), 칼륨 인산 염 버퍼 (1 M, pH 6) 200 mL, 10 %w / v 포도 당 또는 글리세롤 (에 따라 원하는 생성 된 바이오 매스 금액의 30-100 mL x 압력가 10 100 mL를 추가 하 여 매체 완료 일괄 처리), 동안 살 균 500 Biotin (10mg/mL) 솔루션 및 채우기와 멸 균 1 L x 2 mL 증류수.참고: 모든 재료 별도 플라스 크에 압력가 마로 소독 될 필요가 있다. Biotin 압력가 때 파괴 되 고 따라서 0.2 µ m 멤브레인 필터와 살 균 필터를 수 있다. 버퍼링 된 리치 미디어 (BYPG) (1 L) 오토 클레이 브와 1 %w / v 효 모 추출 물 및 2 %w / v 펩 1 L 마 개 병에 증류수의 700 mL. 냉각, 후 별도로 압력가 10 %w / v 글리세롤, 칼륨 인산 염 버퍼 (1 M, pH 6) 200 mL의 30 ~ 100 mL를 추가 하 고 멸 균 증류수 1 L를 채우십시오. 2. 동요 플라스 크 준비 당황 하 게 250 mL에 증류수 5 mL을 추가 플라스 크를 흔들어, 면 옷의 2 개의 층으로 커버와 고무 밴드와 함께 장소에 그것을 해결. 알루미늄 호 일의 조각 천으로 커버. 압력솥 완전 살 균에 대 일 분 동안 121 ° C에서 플라스 크. 각 플라스 크에 잔여 물 플라스 크 및 이전 준비 미디어의 aliquot 50 mL에서 제거 합니다. 3. 야간 문화 접종 뚜껑 약간 적당 한 통 기 통풍 수 있도록 열어두고 동안 50 mL 원심 분리기 튜브에서 YPD (1 %w / v 효 모 추출 물, 2 %w / v 펩, 포도 당 2 %w / v)의 5 mL에서 원하는 식 스트레인의 단일 신선한 식민지와 야간 문화 (ONC)를 시작 합니다. 28 ° C, 100-130 rpm (떨고 직경 2.5 c m) 통에 80% 습도에서 밤 동안 성장 하자. 4. 측정 설치 및 주요 문화 재배 온라인 모니터링 시스템을 설정 하기 위한 적절 한 교정 장치에 대 한 제조업체의 지침을 따르십시오. 모니터링을 위한 적절 한 소프트웨어 측정 스테이션에 블루투스 연결에 대 한 범위에 설치 된 컴퓨터에 놓습니다. 블루투스를 통해 장치를 연결 하는 소프트웨어를 시작 합니다. 바이오 매스 측정 장치에 블루투스 연결 전면에 은색 버튼을 눌러 켭니다. 소프트웨어에서 장치 다음 찾을 장치를 클릭 합니다.참고: 장치 윈도우 작업 줄 아래에 목록으로 나타납니다. 그들이 경우에, 그것은 배터리 충전 컴퓨터 블루투스 연결에 대 한 도달 시간입니다 있는지 확인 하는 것이 좋습니다. 끌어서 화면 측정 용지함의 오른쪽에 사각형을 발견된 장치를 놓습니다. 연결을 클릭 합니다.참고: 연결 된 컨트롤 화면이 나타납니다. 블루투스 연결에 대 한 실행 하는 테스트를 시작 하려면 측정을 클릭 합니다. 실험을 설정 합니다. 시작 측정, 실험의 이름을 클릭 하 고 모니터링 하는 데 필요한 모든 매개 변수를 사용.참고: 라이센스 가능한 측정된 매개 변수 각각의 대 한 필요 합니다. -3 분 간격 을 설정 합니다.참고: 간격 결정 얼마나 자주 측정 포인트 고 모든 측정 지점 이후에 값을 반환. 매 순간을 측정 하는 것은 매우 정확 하 게, 하지만 데이터를 많이 평가 하 더 힘 드는 게 생성 됩니다. 11 평균 측정 포인트 를 설정 합니다.참고:이 설정은 얼마나 많은 측정 포인트는 실제로 모든 3 분 촬영 결정 합니다. 따라서, 출력 11 측정 포인트 이상 11의 평균 값은 s. 샘플에 대 한 이름을 입력 합니다. 각도 이미 (단계 4.1) 전에 보정으로 다음 화면을 건너뜁니다.참고: 테스트 주요 문화를 접종 하기 전에 블루투스 연결에 대 한 실행 안정적인 연결 및 연결 된 컴퓨터의 적절 한 위치를 위해 조언 된다. 또한, 배터리 충전 될 필요가 있다. 600 nm 파장에서 분 광 광도 계에 재배 미디어 (1:20)에 희석 ONC (3.1 단계)의 셀 밀도 측정 합니다. 매체의 50 mL를 접종 (권장 탄소 소스 농도 0.3-1%, 1 단계에에서 설명 된 대로 다른 미디어 가능.) 다음 계산을 사용 하 여 0.05의 OD600 ONC와. 감지기에는 플라스 크를 놓고 28 ° C, 130 rpm 및 80% 습도에 흔들.참고: 플라스 크의 밑바닥에 집착 하 고 잘못 된 값을 응답 하지 셀을 피하기 위해 측정을 시작 하기 전에 문화 떨고 5 분에 게 매우 중요 하다. 소프트웨어에서 측정 시작 을 클릭 합니다. 받아 0.2 mL 샘플 셀 밀도 측정 4 h는 접종 후 고 탄소 소스 면 고갈 (결정 단계 4.7에서에서 설명)에서 triplicates. 재배 미디어 (첫 번째 측정 1:5, 두 번째 측정 1시 20분)에 적절 하 게 샘플을 희석 하 고는 분 광 광도 계에서 600 nm 파장에서 흡수를 측정 한다. 플라스 크를 제거 하기 전에, 심지어는 셰이 커를 중지 하기 전에 항상 소프트웨어에서 측정을 일시 중지 합니다.참고: 감지기 정의 떨고 조건 매개 변수를 기록에 대 한 보정 및 아직도 문화를 기록할 때 말도 측정을 떨어뜨립니다. 또한, 항상 떨고 다시 측정을 시작 하기 전에 5 분 대기 해야 합니다. 셀 밀도 측정 검출기는 바이오 매스와 진짜 셀 밀도 대 한 그냥 값을 제공 하기 때문에 필수적입니다. OD600 값 보정 기능 (x 값)과 온라인 측정 시스템 (y 값)에 의해 얻은 값 spectrophotometrically 여러 timepoints를 측정 하 여 달성 될 수 있다. 값은 선형이 아니라 다음 보정 기능에 따라 로그 관계에.y: 분 광 광도 계에 의해 가져온 OD600 값x: 온라인 측정 시스템에 의해 얻은 값k: 슬로프d: 축 절편기울기와 축 절편 다음 해당 OD600 값으로 값을 변환에 사용할 수 있습니다. Excel에서 같은 timepoint에서 온라인 시스템에서 값에 대해 spectrophotometrically 취득된 세600 값을 플롯할 수 하나. 로그 추세선 및 해당 방정식의 추가 보정 기능 위에 표시 된 줄 것 이다. 탄소 소스 거의 고갈된 (약 12-20 h) 될 때까지 육성. 그 목적에 대 한 산소 농도 0 접근을 셀 지 수 성장 단계에 있는 소프트웨어 다이어그램에서 볼 수 있습니다 때까지 성장 하는 문화를 보자.참고: 이것은이 프로토콜에서 사용 하는 탄소 소스 농도 대 한 경우입니다. 같이 그것은 exemplarily 대표적인 결과 섹션에서 그림 1 때 산소 수준 0에 접근 하 고 셀 지 수 성장에는 탄소 소스 고갈의 timepoint 온라인 모니터링 시스템으로 결정 될 수 있다 단계입니다. 5. 단백질 식 드 억압 Timepoint 단계 4.6에서 설명에 도달 하면 먹이 문화는 무 균 조건 하에서 플라스 크 당 4 개의 피드 디스크의 추가 의해 시작 합니다.참고: 설명 된 조건에서 4 개의 글리세롤 피드 디스크 출시 2mg/h 글리세롤 제조 업체에 따라. 샘플 선택의 분석 결과 의해 단백질 표정 모니터링을 24 시간 마다 복용 하는 동안 60-90 h에 대 한 재배를 계속 (예., Bradford 분석 결과15, SDS 페이지16 또는 활동 분석 실험) 및 밀도 측정 셀. 6. 문화 수확 후 재배의 60-90 h 50 mL 4000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수확을 위한 원심 분리기 튜브에 문화를 작성.참고: (분 비 단백질)에 대 한 상쾌한 또는 (세포내 단백질 식)에 대 한 셀 4000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리에 의해 수확 수 있습니다 및 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 추가 분석을 위해 소프트웨어에서 스프레드시트 파일로 온라인 측정 데이터를 내보냅니다. 모든 플라스 크와 나머지 셀 비활성화를 압력솥에 증류수의 5-10 mL을 입력 합니다.