JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

Представлен подробный протокол для применения нажмите при содействии химия РНК interactome захвата (CARIC) стратегии для идентификации белков, обязательного для обеих кодирования и некодирующей РНК.

Abstract

Всеобъемлющее выявление RNA-связывая протеинов (ОДП) является ключом к пониманию посттранскрипционного регулирования сети в клетках. Широко используется стратегия для захвата ОДП использует сплайсингу [poly(A)] целевой РНК, которая в основном происходит на эукариотические зрелой мРНК, оставляя большинство связывания белков non-poly(A) РНК неизвестные. Здесь мы описываем подробные процедуры недавно сообщили метода называется нажмите при содействии химия РНК interactome захвата (CARIC), который позволяет транскриптом широкий захват ОДП, poly(A) и non-poly(A), объединяя метаболических маркировки РНК, в естественных условиях УФ cross-linking и bioorthogonal пометки.

Introduction

Человеческий геном транскрибируется в различные типы кодирования и некодирующей РНК (ncRNAs), включая мРНК, теорией, tRNAs, малые ядерные РНК (промотор), малые ядрышковые РНК (snoRNAs) и длиной некодирующих РНК (lncRNAs)1. Большинство из этих молекул РНК обладают одежда ОДП и функционировать как рибонуклеопротеида частиц (RNPs)2. Таким образом всеобъемлющее выявление ОДП является необходимым условием для понимания регулирования сети между РНК и ОДП, которая подразумевается в различных заболеваний человека3,,4–5.

За последние несколько лет стали свидетелями большой импульс ОДП, обнаружены в различных систем эукариотической2,6, включая человека7,8,9,10,11, мышь12,13,14, дрожжи9,,1516, данио рерио17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,,2122и паразитов человека23,24,25 . Эти достижения способствовали ОДП захвата стратегии, разработанной в Кастелло и др. 7 и Бальтца и др. 8 в 2012 году, который сочетает в себе в vivo УФ cross-linking РНК и взаимодействуя белками, oligo(dT) захват poly(A) РНК и масс-спектрометрия (МС)-proteomic профилирования на основе. Однако учитывая тот факт, что poly(A) в основном существует на зрелой мРНК, которые составляют для только ~ 3% – 5% эукариотических транскриптом26, эта широко используется стратегия не способна снимать ОДП, взаимодействующих с non-poly(A) РНК, включая большинство ncRNAs и пре мРНК.

Здесь мы приводим подробные процедуры недавно разработанной стратегии для захвата транскриптом всей poly(A) и non-poly(A) ОДП27. Назвать CARIC, эта стратегия объединяет в vivo УФ cross-linking и метаболических маркировки РНК с photoactivatable и «активная» Нуклеозидные аналоги (которые содержат bioorthogonal функциональной группы, могут участвовать в нажмите реакции), 4 – thiouridine (4СУ) и 5-ethynyluridine (ЕС). Шаги, которые являются ключевыми для получения идеальных результатов с ЦАРСКОЕ стратегии являются эффективным метаболических маркировки, УФ реакции структурообразования и нажмите кнопку и поддержания целостности РНК. Потому что Cu(I), используется в качестве катализатора в нажмите реакции может привести к фрагментации РНК, Cu(I) лиганд, который может уменьшить фрагментацию РНК имеет важное значение. Мы опишем, как для выполнения эффективного нажмите реакции в lysates клетки не вызывая серьезной деградации РНК.

Хотя ОДП захвата и идентификации в клетки HeLa только описан в настоящем Протоколе, ЦАРСКОЕ стратегия может применяться для различных типов клеток и возможно для живых организмов. Помимо захвата ОДП этот протокол также обеспечивает упрощенные пошаговые процедуры для MS пробоподготовки и белка идентификации и количественной оценки, которая может быть полезна для тех, кто не знаком с proteomic экспериментов.

Protocol

Предупреждение: Когда это применимо, реагентов, используемых следует приобрести в виде свободных РНКазы или растворенных в РНКазы бесплатно, растворителей (в большинстве случаев, в диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды). При обработке образцов РНК и реагенты, RNase бесплатно, всегда надев…

Representative Results

Представитель результаты контроля качества шаги представлены. Результаты включают показатели анализа флуоресценции в гель, описанный в шаге 2.3.2 (рис. 1), Западный анализ помаркой описано в шаге 4.1.3 (рисунок 2A) и Серебряный пятнать анализ?…

Discussion

Сохранение целостности ярмарка РНК является одним из ключей к успешной ЦАРСКОЕ экспериментов. С соответствующие лигандами Cu(I) и тщательной работы деградация РНК может быть значительно меньше, хотя наблюдалось частичной деградации. Коэффициенты замещения ЕС и 4СУ в экспериментальных ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается национальные естественные науки фонд из Китая грантов 91753206, 21425204 и 21521003 и Национальный исследовательский ключ и 2016YFA0501500 развития проекта.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).

Tags

RNA-binding ProteinsCARICClick ChemistryRNA-interactome CapturePost-transcriptional Gene RegulationMRNANon-coding RNAHeLa CellsEU4SUUV Cross-linkingCell LysisRNA-protein Interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image