캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

인간 게놈은 코딩 및 noncoding RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs tRNAs, 작은 핵 RNAs (snRNAs), 작은 nucleolar RNAs (snoRNAs), 그리고 긴 비 코딩 RNAs (lncRNAs)¹의 다양 한 형식으로 복사할 수 있습니다. 대부분 이러한 RNAs의 RBPs의 의류를 보유 하 고 ribonucleoprotein 입자 (RNPs)²로 작동. 따라서 RBPs의 포괄적인 식별 다양 한 인간 질병^3,,45에 연루 RNAs 사이의 RBPs, 규제 네트워크를 이해 하기 위한 전제 조건입니다.

지난 몇 년 동안 다양 한 진 핵 시스템^2,6, 인간의^7,,89,10,11를 포함 하 여 발견 RBPs의 큰 향상을 목격 했다 마우스^12,,1314, 효 모^9,,1516, zebrafish¹⁷, 초파리 melanogaster^18,19 , 꼬마 선 충¹⁶, 애기 thaliana^20,,2122, 그리고 인간의 기생충^23,24,25 . 이러한 진보 카스텔로 연구진이 개발한 RBP 캡처 전략에 의해 촉진 되어 있다 ⁷ , Baltz 외. ⁸ 2012 년에 RNA와 단백질 상호 작용, 많은 RNAs의 oligo(dT) 캡처 및 질량 분석 (MS)의 cross-linking vivo에서 UV-proteomic 프로 파일링 기반. 그러나, 그 많은 계정에 대 한 3%-5%만 진 핵 transcriptome²⁶의 성숙한 mRNAs에 주로 존재 하는 사실을 감안할 때이 널리 사용 되는 전략은 RBPs non-poly(A) RNAs, 대부분 ncRNAs를 포함 한 상호 작용을 캡처할 수 그리고 사전 mRNAs입니다.

여기, 우리는 많은 non-poly(A) RBPs²⁷transcriptome 전체 캡처에 대 한 최근 개발 된 전략의 세부 절차를 보고합니다. CARIC 되 나,이 전략 결합 vivo에서 UV cross-linking 및 photoactivatable 및 “클릭” nucleoside 유사 체 (는 클릭 반응에 참여할 수는 bioorthogonal 기능 그룹 포함)와 RNAs의 대사 라벨 4- thiouridine (4SU), 그리고 5-ethynyluridine (유럽 연합). CARIC 전략 이상적인 결과 얻기 위해 중요 단계는 효율적인 대사 라벨, UV cross-linking 및 클릭 반응, 그리고 RNA 무결성의 유지 관리 합니다. 클릭 반응에서 촉매로 사용 하는 Cu(I)는 RNAs의 조각화를 발생할 수 있습니다, 때문에 RNA 조각화를 줄일 수 있는 Cu(I) ligand 필수적 이다. 우리는 심각한 RNA 저하를 유발 하지 않고 세포 lysates의 효율적인 클릭 반응을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

RBP 캡처만 HeLa 세포에서 식별이이 프로토콜에서 설명 하는 있지만 다양 한 세포 유형으로, 그리고 아마도 생물 CARIC 전략을 적용할 수 있습니다. RBP 캡처, 게다가이 프로토콜 또한 MS 샘플 준비, 단백질 식별 및 정량화, proteomic 실험에 익숙하지 않는 사람들을 위해 도움이 될 수 있는 효율적인된 단계별 절차를 제공 합니다.