Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie
Summary
Ein detailliertes Protokoll zur Anwendung der Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie um Proteine binden beide Codierung und Forensisches identifizieren RNAs wird vorgestellt.
Abstract
Eine umfassende Kennzeichnung der RNA-bindende Proteine (RBPs) ist Schlüssel zum Verständnis der posttranskritionelle regulatorischen Netzwerks in den Zellen. Eine weit verbreitete Strategie für RBP-Capture nutzt die Polyadenylation [Poly] Ziel RNAs, die tritt meist auf Eukaryotische reifer mRNAs, verlassen die meisten bindende Proteine der non-poly(A) RNAs nicht identifizierte. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer kürzlich berichtet Methode bezeichnet Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC), die die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs ermöglicht durch die Kombination der metabolischen Kennzeichnung von RNAs in Vivo UV-Vernetzung und Bioorthogonal zu markieren.
Introduction
Das menschliche Genom ist in verschiedenen Arten der Codierung und Forensisches RNAs (NcRNAs), einschließlich der mRNAs, rRNAs und tRNAs, kleinen nuklearen RNAs (SnRNAs), kleinen Nukleolus RNAs (SnoRNAs) und lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs)1transkribiert. Die meisten von diesen RNAs besitzen Kleidung der RBPs und fungieren als Ribonucleoprotein Partikel (RNPs)2. Daher ist eine umfassende Kennzeichnung der RBPs Voraussetzung zum Verständnis der regulatorischen Netzwerk zwischen RNAs und RBPs, die an verschiedenen Krankheiten beim Menschen3,4,5beteiligt ist.
Die letzten Jahren verzeichnen einen großen Schub von RBPs entdeckt in verschiedenen eukaryontischen Systemen2,6, einschließlich menschliche7,8,9,10,11, Maus12,13,14, Hefe9,15,16, Zebrafisch17, Drosophila Melanogaster18,19 , Caenorhabditis Elegans16, Arabidopsis Thaliana20,21,22und menschliche Parasiten23,24,25 . Diese Fortschritte haben durch eine RBP-Capture-Strategie von Castello Et Al. entwickelt erleichtert 7 und Baltz Et al. 8 im Jahr 2012 verbindet in Vivo UV-Vernetzung der RNA und seinen interagierenden Proteine, oligo(dT) Erfassung von poly(A) RNAs und Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomic profiling. Allerdings ist angesichts der Tatsache, dass poly(A) meist auf Reifen mRNAs vorhanden ist, die für nur ~ 3 % – 5 % der eukaryotischen Transkriptom26ausmachen, diese weit verbreitete Strategie nicht in der Lage RBPs Interaktion mit non-poly(A) RNAs, einschließlich die meisten ncRNAs und Pre-mRNAs.
Hier berichten wir über die Modalitäten einer neu entwickelten Strategie für die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs27. CARIC genannt, verbindet diese Strategie in Vivo UV-Vernetzung und metabolische Kennzeichnung von RNAs mit Photoactivatable und “anklickbar” Nukleosid-Analoga (enthält eine Bioorthogonal funktionelle Gruppe, die bei Klick Reaktion teilnehmen können), 4 – Thiouridine (4SU) und 5-Ethynyluridine (EU). Die Taste, um optimale Ergebnisse mit der CARIC-Strategie sind Schritte sind effiziente metabolische Beschriftung, UV-Vernetzung und klicken Sie auf die Reaktion und die Aufrechterhaltung der Integrität der RNA. Da Cu(I) verwendet als Katalysator in Klick Reaktion die Zersplitterung des RNAs verursachen können, unbedingt ein Cu(I) Liganden, die RNA Fragmentierung reduzieren können. Wir beschreiben, wie effiziente Klick Reaktionen in Zelle Lysates durchführen, ohne dass es zu schweren RNA-Abbau.
Obwohl RBP erfassen und Identifikation in HeLa-Zellen wird nur in diesem Protokoll beschrieben, kann die CARIC Strategie zu verschiedenen Zelltypen und möglicherweise zu lebenden Organismen angewendet werden. Neben RBP erfassen bietet dieses Protokoll auch optimierte schrittweise Anleitungen für MS Probenvorbereitung und Proteinidentifizierung und Quantifizierung, die hilfreich für diejenigen, die nicht vertraut mit Proteomic Experimente sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Aufrechterhaltung der Messe RNA-Integrität ist einer der Schlüssel zum erfolgreichen CARIC Experimente. Mit entsprechenden Liganden Cu(I) und sorgfältige Bedienung kann RNA-Abbau deutlich reduziert werden, obwohl Teilabbau beobachtet wurde. Die Ersatz-Verhältnisse der EU und 4SU in experimentellen Proben sind 1,18 % bzw. 0,46 % (Daten nicht gezeigt). Für intakte RNAs mit einer Länge von 2.000 nt, ca. 90 % der RNAs enthalten mindestens eine EU und eine 4SU. Für teilweise abgebauten RNAs mit einer Länge von 1.0…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation von China Zuschüsse 91753206, 21425204, und 21521003 und von nationalen Key Forschungs- und Entwicklungsprojekt 2016YFA0501500 unterstützt.
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
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