Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella

Рианодиновыми рецепторы (RyRs) являются конкретные ионные каналы, которые посредником проникновение ионов Ca^{2 +} через мембраны саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Таким образом они играют важную роль в сокращении возбуждения муфты процесса. В своей функциональной формы, RyR собирает как гомо Тетрамер с молекулярной массой > 2 MDa, с каждого подразделения, состоящий из ~ 5000 аминокислотных остатков. В млекопитающих, существует три изоформ: RyR1 – скелетных мышц, типа RyR2 – сердечной мышцы и RyR3-повсеместно выражена в различных тканях¹.

В насекомых существует только один тип RyR, который выражается в мышечной и нервной ткани². Насекомое RyR больше похож на млекопитающих RyR2 с идентификатором последовательности около 47%³. Diamide инсектициды, ориентированные на RyR чешуекрылых и Coleoptera разработаны и продаются в крупных компаний, как Bayer (flubendiamide), DuPont (Хлорантранилипрол) и “Сингента” (cyantraniliprole). С момента своего запуска относительно недавно diamide инсектициды стали одним из быстро растущих класса инсектицидов. В настоящее время продажи этих трех инсектицидов ежегодно пересекли 2 миллиарда долларов США с темпами роста более чем на 50% с 2009 года (Agranova).

Недавние исследования сообщили развитие резистентности у насекомых после нескольких поколений использования этих инсектицидов^4,5,6,,78. Сопротивление мутаций в трансмембранных доменов RyRs от diamondback моли (ДБМ), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) и соответствующие позиции в томатном яблонный, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) показывают, что регион могут быть вовлечены в diamide инсектицид привязки, как этот регион известен быть критическим для стробирования канала^4,8,9. Несмотря на обширные исследования в этой области точные молекулярные механизмы diamide инсектицидов остаются недостижимой. Кроме того неясно, затрагивают ли мутации сопротивления взаимодействия с гидразиды прямо или allosterically.

Ранее проведенные исследования сообщили структуру нескольких доменов RyR от видов млекопитающих и структура полнометражных RyR1 млекопитающих и RyR2 рентгеноструктурного анализа и крио электронная микроскопия, соответственно^{10,11, 12,13,14,,1516,,1718,19,20,21} . Но пока что, нет структуры насекомых RyR сообщалось, который запрещает нам понимание молекулярных тонкости функции рецепторов, а также молекулярные механизмы действия инсектицидов и развития резистентности к инсектицидам.

В этой рукописи мы представляем обобщенных протокол для структурной характеристики N-терминальный β-трилистник домена рецептора рианодиновыми от моли diamondback, разрушительных вредителей, заражая крестоцветных культур во всем мире²². Конструкция была разработана согласно опубликованной кролик RyR1 NTD кристалл структур^23,24и крио EM структурной модели^{16,,1718,19, 20 , 21}. это первый разрешением структура для насекомых RyR, который раскрывает механизм для стробирования канала и предоставляет шаблон важные для развития вегетационных инсектицидов, с использованием проектирования на основе структуры наркотиков. Для разяснения структуры мы заняты рентгеноструктурного анализа, который рассматривается как «золотой стандарт» для определения структуры белка в вблизи атомных резолюции. Хотя процесс кристаллизации является непредсказуемым и трудоемкий, этот шаг за шагом протокол поможет исследователям выразить, очищают и в целом характеризуют другие домены насекомое RyR или любые другие белки.