Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков
Summary
Здесь мы представляем протокол для мышиных в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков с биотин. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса.
Abstract
Протеинурия результаты от нарушения клубочковых фильтр, который состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes с их щели диафрагмы. Деликатный структура клубочковых фильтра, особенно щели диафрагмы, опирается на взаимодействие различных клеток поверхности белков. Изучая эти клетки поверхности белки до настоящего времени была ограничена в vitro исследования или гистологический анализ. Здесь мы представляем мышиных в vivo biotinylation маркировки метод, который позволяет исследование белков клубочковых клеток поверхности физиологического и патофизиологические условиях. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса. Полуфинал количественный поверхностного залегания клубочковых клеток легко доступны с этот новый метод и все белки доступным для перфузии биотина и иммунопреципитации могут быть изучены. Кроме того изоляция клубочков, с или без biotinylation позволяет далее анализ клубочковых РНК и белка, а также первичных клубочковых клеток культуры (т.е. первичной Подоцит клеток).
Introduction
Протеинурия является отличительной чертой клубочковых травмы и обычно сопровождает нарушение клубочковых фильтра1. Клубочковой фильтрации состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes. Деликатный молекулярной структуры клубочковой фильтрации очень динамичный и подвергать белка клеточной поверхности оборота как здоровые и больные почки2,3,4,5,6 . Эндоцитоза поверхностных белков клеток было показано, быть необходимым для выживания podocytes7. Трансмембранные белки, выраженные на podocytes Nephrin и podocalyxin. Nephrin является основой клубочковых щели диафрагмы, в то время как podocalyxin является sialoglycoprotein, покрытие процессов вторичного ноги podocytes8,9,10. Endocytic оборот ранее было показано, для nephrin и podocalyxin3,11,12,,1314.
В меру наших знаний эндоцитоза белков клеток поверхности не еще был описан в клубочковых клеток эндотелия в литературе. Однако эндотелиальные клетки в целом выразить все необходимые белки для различных типов эндоцитоза (то есть, зависящих от Клатрин, плот зависимая эндоцитоза)15,16. Таким образом, эндотелиальных клеток поверхности людьми может быть изучена с помощью этого метода, используя, например, сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины и внутриклеточных Межмицеллярная молекула (ICAM-2) как клетка поверхности белка маркера для клубочковых клеток эндотелия17 .
К сожалению не существует точного в vitro модели для деликатной трехслойное клубочковых фильтра, в котором ячейки могут быть изучены людьми поверхности белка. Цель этого метода является таким образом изучить клубочковых белка торговли людьми, в естественных условиях. Кроме того этот протокол содержит информацию о том, как изолировать клубочков, позволяя дальнейшего анализа клубочковых РНК, белки или клетки. Подобные клубочковых изоляции, что методы были описаны различные группы18,19.
Ранее мы и другие использовали ex vivo маркировки клубочковых клеток поверхности белков biotinylation2,3,4,,2021. Однако в этом методе ex vivo , изолированные клубочков были подвержены механическому воздействию, которое может повлиять на endocytic людьми. Кроме того Этикетировочный иммунофлуоресценции клубочковых клеток поверхности белков широко использовалась в литературе2,20,22. С помощью этого метода однако, только небольшое количество белков могут быть проанализированы в течение одного слайда, и количественный иммунофлюоресценции изображений часто бывает трудно.
Этот роман в vivo метод предлагает надежный инструмент для изучения клубочковых клеток поверхности белка изобилия и людьми точно в здоровые и больные почки, и он может использоваться как дополнение к иммунофлюоресценции тесты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный метод позволяет успешно изоляции клубочков расследовать клубочковых RNA или протеина. Кроме того культуры первичной клубочковых клеток может выполняться из изолированных клубочков. Если биотина применяется перед клубочковых изоляции, маркировки клубочковых клеток по?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Blanka Duvnjak за ее исключительной технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1-М.В и QU280/3-1-I.Q. Спонсора имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных, анализ данных, решение опубликовать и подготовка рукописи.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
