小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究
Summary
ここでは、小角 x 線散乱 (SAXS) を高分子の構造を表す低解像度の封筒に情報を取得する利用できる方法を提案します。X 線結晶構造解析や核磁気共鳴などの高分解能構造技術と組み合わせて使用すると、小角はマルチ ドメイン蛋白質および高分子複合体の溶液に詳細な洞察力を提供できます。
Abstract
複数の球状ドメインを持つタンパク質を含むタンパク質間相互作用は、どのような複合体のフォームと、どのようにドメイン指向位置を決定するための技術課題を提示します。ここでは、第一原理計算モデルを用いた多成分系である特定のドメインの仲介する相互作用を解明するため潜在的なプロトコルが記述されています。高分子とそのアセンブリの溶液構造を計算するこの方法は x 線小角散乱 (SAXS)、クロマトグラフィー、およびハイブリッド アプローチで一緒に原子分解能の構造からのデータを統合することを含みます。具体的な例は、フルレングス nidogen 1、細胞外マトリックス蛋白質を組み立てると拡張、湾曲したナノ構造の複合体のことです。その球状ドメインの 1 つにラミニン γ-1、基底膜の構造をアタッチします。これは柔軟なマルチ ドメイン蛋白質複合体の正確な構造を決定するための基礎を提供、自動化ロボットとサイズ排除クロマトグラフィー システムと相まってシンクロトロン源によって可能です。これにより、迅速分析直前の小角 x 線散乱データ コレクション複数のオリゴマー状態が区切られています。分析には、半径の旋回、粒子分子形状寸法とドメイン間のペアリング情報が得られます。また構成タンパク質の高分解能構造のあてはめによる複合体の 3 D モデルを生成するためのプロトコルであります。
Introduction
細胞は、シグナル伝達カスケード構造の整合性の維持などの細胞機能を遂行する分子機械として機能する蛋白質の複雑なネットワークを含んでいます。これらの異なるコンポーネントが移動し、三次元空間での対話の方法は高分子の特定の機能をもたらします。蛋白質の構造、ダイナミクス、および関数の決定における相互作用の重要性は、これらの特性を測定する継続的に進化し、複雑な技術の必要性を提供しています。これらの核磁気共鳴 (NMR) や x 線結晶構造解析 (半値幅) 最近、クライオ電子顕微鏡法 (CEM) 高分解能構造について説明します。しかし、半値幅や CEM 生体分子の多くの州の 1 つの構造をもたらすし、NMR による立体構造決定は通常小さい球状蛋白質立体構造のダイナミクスに関する情報が不足します。これらの制限を克服する方法の 1 つは、大規模なマルチ ドメイン、または複合系の分子の封筒を作成し、グローバルを解明する高解像度の硬質高分子構造を結合小角 x 線散乱 (SAXS) を利用するにはアーキテクチャと動的機能。
小角 x 線散乱だけでなく構造も複雑なを表示する動的特性に洞察力を与える約 10-20 Å の1, の解像度を持つ高分子複合体の低解像度エンベロープが生成されます。小角 x 線散乱は、分子構造を明らかにする x 線を利用して、溶液中の粒子のランダムな等方性方向に回折することはなく、散乱原子分解能をもたらすことはできませんもたらさないという点で半値幅とは異なりです。代わりに、巨大分子表示の構造の平均を表す「封筒」巨大分子の電子が生成されます。この情報は、領域の単一タンパク質またはサブユニット組織の柔軟性や大きい、多蛋白質複合体のダイナミクスを推論する以前解決原子分解能構造の直接フィッティングで使用できます。シンクロトロン高エネルギー単色 x 線を用いたまたは秒単位のサンプル露出時間 (図 1) ではなく、数時間を必要とする弱い x 線源を提供する社内のソースからのデータが収集されます。小角 x 線散乱データは単一の実験のセットアップとバッファー、システム上有用なデータのラウンドを収集するために長時間を必要とするいくつかのサンプルから収集されました。サンプルする必要があります、したがって、不安定になり非集約動的光散乱 (DL) など分析超遠心機 (AUC) 解析を高品質小角 x 線散乱データ2を用いて検証可能な品質管理手法に基づく少なくとも数時間,3ここで簡潔にの第一原理計算を用いたモデリング感動的原理を使用、利点、制限と試料調製とフォーカスには多額のデータ収集と分析、小角 x 線散乱の実用的な説明を一緒に提供、。細胞外マトリックス蛋白質 nidogen 1 とラミニン γ-1 実験例として。
原則、利点、および SAXS の制限:
小角 x 線散乱の背後にある基本原理は比較的簡単です: 興味の macromolecule(s) の単分散準備のソリューション キャピラリー内に配置され、高エネルギー単色 x 線ビームにさらされています。光子は、同じエネルギーと波長の放出される球面波の結果、振動を開始する原子殻の電子を引き起こします。以来、すべての電子が振動すると、一定の背景は達成され、高分子の電子密度の結果の背景に対照的であります。2Θ 散乱角の関数として生じる散乱強度を収集 (図 1)。
その他のテクニック一方 XRC NMR および CEM は原子レベルでの構造情報を提供するなど、他の技術を提供することはできません小角に複数の利点があります。小角 x 線散乱はほぼすべてのバッファーで実行できる、特別な前処理を必要としません。これは、モノラルまたは二価陽イオンや pH4、5の変化の有無など、さまざまな条件下での高分子の構造と挙動の勉強に特に重要です。小角散乱による高分子6、何か他の上場の技術することができます闘争の柔軟な領域に関する情報を提供する機能があります。強力な無料技術高分子の安定した部分と全体高分子や CEM、NRM XRC 研究または複雑な小角 x 線散乱と低解像度の分析など様々 な分析ツールを使用する結合としたがって、SAXS が使用できます。FoXSDock7や8CRYSOL。小角 x 線散乱ソリューション手法ですが、以降は半値幅から得られたものなどの静的構造が解決策6で一貫したかどうかを確認するよく使用されます。小角 x 線散乱では、比較的少量のサンプル投資 (通常 50-100 μ L) と実験時間 30 分 (1 h) の比較的少量を必要とする技術であることの利点もあります。
小角 x 線散乱の最大の制限は、サンプル集計および/または不適切な構造の予測につながることができる低下する脆弱性です。集計、5% としても低い最大粒子寸法 (Dmax) と (Rg) 断面二次半径の過大評価につながる、非常に高い量で光が散乱することができます。その一方で、サンプルの劣化は、分子特性の過小評価につながります。この脆弱性は、小角 x 線散乱されて平均法、つまり信頼性と再現性のある結果を達成するために重要なサンプルの均質性から発生します。小角 x 線散乱によって分析されるサンプルは浄化と変化とネイティブ電気泳動, サイズ排除クロマトグラフィー, 動的光散乱法など、同質性のチェック方法の複数を受けるべきである、したがってと分析遠心。多くの場合、小角 x 線散乱ビームラインは、最終の品質管理としての高速液体クロマトグラフィーによるサンプルの小角 x 線散乱 (SAXS-S)3,9前にステップ実行されます。複数濃度の小角 x 線散乱データが収集され、各データ セットのRgを比較して必要があります、粒子間相互作用の粒子の過大評価の結果集計を行いを避けるために近い類似性を確保寸法、不正確なデータ分析につながるとモデリングします。濃度と粒径に依存する散乱、小さい高分子濃度範囲のより詳細な最適化を必要があります。これは、相反定理、大きなサイズが小さな角と角の大きいに向かって小さいサイズに向かって散布です。これは IOは6R に比例して粒子半径 R は、データ コレクションで明示します。小角 x 線散乱の最終的な制限は、露光データの歪みにつながることができます中にサンプルに照射損傷の可能性です。これが発生していないことを確認する小角 x 線散乱サンプル照射前後にサンプルの質を比較することをお勧めします。
Protocol
Representative Results
Discussion
この紙含むバッファー減算 Guinier 解析、Kratky 解析、データのマージ、P(r) 配布プロトコルのセクションで概説した小角 x 線散乱データ分析の重要なステップです。経験的ビーズ モデリングはここで詳しく説明する多岐にのみ簡単に説明されて、したがって.
シンクロトロン (例えばドイツで DESY、英国のダイヤモンド、フランスの ESRF)、それは非常に小さな端数の小角 x 線散乱データを収集することが可能 (~ 数 μ L) 分数としてそれぞれのサンプルの s 列から溶出されるがそれは接続されている行内 (図 1 を参照).弾性散乱 SAXS データはバッファーの減算は、場所を取ることができる前に、楽器の製造元または放射によって提供されるパッケージを使用を平均して放射状。結果の 1 次元データY(私(q)) での散乱光の量を表します-軸と散乱角度 (q= 4πsinθ/λ、λ はXの事件の波長-光線) と図 1に記載されています。プリムス/qt12プログラムは直接バッファーにより任意の背景を減算するために使用、セクション 1.1 で説明。他のプログラムなど。ScÅtter43 https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAと bioXtas 生44 (で利用可能な https:// で利用できるチュートリアル ( www.bioisis.netで利用可能なダウンロード)bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) ATSAS パッケージに代わるものとして活用することができます。
Guinier 分析では、サンプル集計、均質性、低s地域14から小角 x 線散乱データに基づく興味の高分子の旋回半径 (Rg) を提供することについて説明します。Q 1.30 までの最大範囲とカーブフィッティングに続いて、各濃度から得られた小角 x 線散乱データのプロットを構築プリムス/qt とRgx。非線形 Guinier の集計結果プロット15,16に対し、単分散試料はこの地域 (図 2 D) の線形 Guinier プロットを提供しなければなりません。Guinier 解析は線形、剛体モデルを実行または低解像度モデルのアンサンブルを構築するかどうかを決定する際に便利です Kratky プロットと関心の高分子の”unfoldedness”の度がご覧いただけます。球状タンパク質は、分子を拡張に対し、釣鐘型の曲線にプロットや展開のペプチドが高原あるいはq広範囲の増加し、ベル形状 (図 2) を欠いているに表示されます、Kratky に表示されます。
1 D の散布 (図 2 D) の低q領域からデータ ポイントに限れば Guinier 分析からRgを取得、ただし、それは間接フーリエ変換を実行するほとんど、データセット全体を使用することln (I (q))対(q) の逆空間情報DmaxやRgに関する情報を提供する実空間距離分布関数 (P(r)) に変換するには(図 2 b)P(r) プロットの形状は、金利18,19の高分子の総ソリューション構造を表します。逆空間データの実空間データへの変換が重要ですが、詳細な説明は本稿の範囲内でないです。したがって、各パラメーターを理解する Svergun20の記事を参照してください。
バッファー減算個々 の濃度のデータはRg、Kratky 解析を用いた折り畳みパターンの調査に続いての一貫性のある値を持つ Guinier 分析を介して処理されます、これらのデータをマージすることができます。マージされたデータ nidogen 1、ラミニン γ-1、および、複雑なは、上記のように処理された結果 P(r) プロットの2 b を図で掲載されています。理想的には、1 つもペア距離分布関数と同様RgとD最大値各濃度の小角 x 線散乱データを提供する場合を決定する各濃度 P(r) を計算する必要があります。RgおよびDmaxは濃度の広い範囲にわたって同様のまま、ユーザーが選択ください。信号によっては、データをデータのマージ前に切り捨てることができることに留意。調査中の高分子の分子量や濃度が低い場合しばしばケースです。
様々 なモードで DAMMIN を使用して低解像度形状解析を行うことが (例えば高速、低速、エキスパート モードなど)。高速モードは、P(r) のプロットは、質の良いモデルを提供している場合を評価するための理想的な最初のステップです。通常、少なくとも 10 モデルは χ (0.5 〜 1.0 の値は良いと考え私たちの広範な仕事に基づいてと呼ばれる適合パラメーターの低い良さと、低解像度構造の観点からの再現性のある結果が得られるかどうかをチェックする各 P(r) プロットの得する必要があります。)、実験的に収集したデータとモデルから派生したデータ間の契約を記述する値。文書の目的のため我々 は通常遅いまたはエキスパート モードを使用し、少なくとも 15 のモデルを計算します。DAMMIN、ほかそれ DAMMIF37と同様、GASBOR38の高速バージョンにも選択肢であります。さらに、蛋白質蛋白質や蛋白質・核酸酸錯体を研究するため、高分子として、複雑な個々 の小角 x 線散乱データの同時適合を容易に、MONSA プログラム35を使用することが可能です。RNA 蛋白質の相互作用の調査のためにまた高解像度モデルの計算の詳細については、パテルら3で最近の記事を参照してください。
SAXS は間違いなく他の構造生物学のツールと結果を独自に使用することができます低解像度の構造データまたは情報を明らかにする高解像度技術と組み合わせて高い相互補完法ですが理論的には単純です高分子構造のダイナミクス。高分子およびその錯体の単分散準備を取得できる限り、ソリューションの構造やあらゆる種類の生体高分子との相互作用を研究する小角 x 線散乱を利用できます。ここで説明する複雑な場合、それは驚くべきその少ない両蛋白質のドメインの残りの部分は、他との対話を自由にアクセスできるに対し窒素 1 およびラミニンの全体的なアクセス可能な表面領域の 10% より γ 1 はこの複合体に埋葬されました。その構造的な剛性 (図 3) を維持するために細胞外のマトリックス蛋白質。複合体のような情報の取得 ~ 240kDa の x 線結晶構造解析、NMR、Cryoem 顕微鏡など他の構造生物学の技術を使用して非常に困難でしょう。
X 線結晶構造解析や NMR 経由で暴く蛋白質の構造は本質的に時間のかかるプロセスです。構造決定のこのネックは SAXS が構造の手法としてその強さを示しています 1 つの領域単一の小角 x 線散乱実験用データ集録は、1 時間未満を取ることができる、合理化された解析ソフトウェアの助けを借りて、分析することができる迅速かつ効率的に。小角散乱による高解像度データが使用できる前に、それは高分子構造の低解像度モデルを提供するためスタンドアロン技術として構造研究のスループットを大きく可能性があります。他の構造技術への障壁は、長い期間にわたってタンパク質発現と安定性の高いレベルを必要とするデータ集録について非常に純粋な集中されたサンプルの要件です。小角 x 線散乱のサンプル純度、濃縮をする必要も、試料の液量が約 100 μ L の小角 x 線散乱解析その他の構造技術と比較して比較的安価な方法を作るします。また、サイズ排除クロマトグラフィーと相まって SAXS なっている追加の品質管理手順を提供します。最近柔軟なシステムを解明するアンサンブル最適化法 (EOM)45,46を使用して NMR と x 線溶液散乱データの組み合わせで強力な進歩がずっとあります。メルテンスと Svergun47による最近の論文、NMR と組み合わせて使用されている小角 x 線散乱データの他の多くの例と共に、NMR との組み合わせで EOM 小角 x 線散乱の複数の最近の例を述べる。小角 x 線散乱の分野で進歩が見られ継続的に、新しい技術が小角 x 線散乱と組み合わせて使用するため開発された、ないだけ無料で、その他の構造の技術。その結果、柔軟性によって関数が定義されている動的システムを特徴付けるため NMR と組み合わせて特に時間をかけて小角 x 線散乱の需要は増えるだけと考えています。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、アルバータ州プリオン研究所、キャンパス アルバータ州イノベーション プログラム (RCP-12-002 C) レベル RGPIN-2018-04994 に支えられてきた/ミズーリ州 TRP に授与されたアルバータ州革新バイオ ソリューション (201600018) の補助金は RNA のカナダの研究の椅子と蛋白質の生物 (201704) レベル検出グラント (RGPIN-2017-04003) を認めていると。TM は資金を供給されたトロピカルへのレベル検出交付金によって
Materials
| HEK 293 EBNA Cell Line | In-Lab availability | – | Cell line used to overexpress protein(s) |
| Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin | GE Healthcare | 17524801 | Affinity protein purification resin |
| Superdex 200 Increase 10/300 | GE Healthcare | 28990944 | SEC Column |
| ÄKTA Pure FPLC | GE Healthcare | – | FPLC System |
| Nanodrop | Nanodrop | – | Spectrophotometer |
| Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.) | |||
| S-MAX3000 | Rigaku | – | SAXS Pinhole Camera System |
| Zetasizer Nano-S | Malvern Instruments Ltd | – | Dynamic Light Scattering instrument |
| 0.1µm Filter | Millipore | JVWP04700 | Used to Concentrate Sample Prior to DLS |
| Thrombin cleavage kit | abcam | ab207000 | Thrombin cleavage to remove His tag |
| Strep-Tactin Sepharose Column | IBA | 2-1201-010 | Strep-Tag Affinity Purification |
| D-desthiobiotin | Sigma-Aldrich | 533-48-2 | Elution of Strep Tag Protein |
| Software | |||
| SAXGUI | Rigaku | – | Data Collection for SAXS and data reduction |
| ATSAS Suit | Franke et al., 2017 | – | SAXS Data Analysis Software program suite |
| PRIMUS | Konarev et al., 2003 | – | Buffer Subtraction |
| GNOM | Svergun, 1992 | – | Rg, Dmax and p(r) Calculation |
| DAMMIF | Franke and Svergun, 2009 | – | Ab initio model calculation |
| DAMAVER | Volkov and Svergun, 2003 | – | Averaged Solution Conformation calculations |
| MONSA | Svergun, 1999 | – | Simultaneous model fitting for the complex |
| GASBOR | Svergun et al., 2001 | – | Alternative Ab initio model calculations |
| DTS Software V6.20 | Malvern Instruments Ltd | – | DLS supplied instrument software |
| PyMOL | Schrodinger, LLC. | – | The PyMOL Molecular Graphics System V2.0 |
| The Protein Data Bank | Berman et al., 2000 | – | PDB ID: 1NPE |
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