Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

1. рекомбинантных белков Выражение Envoplakin ПДР (E-ОД) и 99 виментин-249 (VimRod) Трансформировать E. coli BL21(DE3) клетки с плазмида, содержащий нужный ген. Распространение на плиты агара, содержащие 100 мкг/мл ампициллин ячейки. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь. Выбрать один колонии и прививать потрясающий бульона (ТБ) 20 мл раствора, содержащего 100 мкг/мл ампициллин выбрать для плазмида. Растут культуры при 37 ° C при встряхивании (180 об/мин) на ночь. Передача культуры всего 20 мл до 1 Л ТБ, содержащий ампициллина 50 мкг/мл. Инкубировать культуры при 37 ° C с встряхивания на 180 об/мин до од600 = 0,6-0,8. Снизить температуру на 18 ° C и побудить выражение протеина, добавив изопропиловым β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мм. Продолжать инкубации при 18 ° C с встряхивания на 160 об/мин на ночь чтобы позволить выражения протеина. Урожай клетки центрифугированием культуры на 8000 x g 15 мин Decant и удалить супернатант. Мыть собранный клетки, resuspending клетки Пелле в приблизительно 40 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS: 20 мм фосфатного буфера, рН 7,4, 120 мм NaCl). Передать ресуспендирования Тюбик 50 мл. Центрифуга снова на 8000 x g за 15 мин. Декантируют и удалить супернатант. Немедленно начать очищение протокол или заморозить гранулы клеток при-20 ° C для использования в будущем. Выражение гетерогенны помечены белка Трансформировать E. coli BL21(DE3) клеток и подготовить 20 мл закваски как 1.1.1-1.1.2. Передача культуры всего 20 мл до 1 Л обогащенного ТБ, содержащий дополнительные 4.0 g Триптон, 5,0 г NaCl и 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировать культуры при 37 ° C при встряхивании в 160 об/мин до од600 = 1,6-1.9. Урожай 1 Л культура центрифугированием в 8000 x g 15 мин Decant и удалить супернатант. Помыть лепешка клеток, осторожно resuspending в примерно 40 мл PBS и передачи ресуспендирования Тюбик 50 мл. Центрифуга снова на 8000 x g 15 мин Decant и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл M9 минимальные средства массовой информации (Таблица 1) и передать оставшуюся часть 950 мл M9 минимальные средства массовой информации, содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Добавьте 50 мл питательной смеси фильтр стерилизованные (таблицы 2 и 3). Акклиматизировать культуры до 18 ° C на 30 минут перед добавлением IPTG в конечной концентрации 1 мм. Инкубируйте на ночь на 18 ° C с встряхивания на 160 об/мин. Урожай клетки как в разделе 1.1.4-1.1.6. 2. иммобилизованные метал близость хроматографии (ИАЦ) очистки VimRod и E-PRD Очистка His6-меткой VimRod Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл/г PBS, содержащий ингибитор протеазы коктейль не хватает ЭДТА. Однородный с 12 ударов в Dounce ткани гомогенизатор для улучшения лизиса клеток в следующем шаге. На льду sonicate суспензию клеток на импульса 1/1 сек выкл, 80% амплитуды для в общей сложности 1,5 мин повторить sonication два дополнительных раз, осторожно закрученного на льду между запусками для предотвращения перегрева. Центрифугуйте образцы на 75 000 x g 45 мин Decant и фильтр супернатанта, с помощью шприца фильтра (0,45 мкм). Сбалансировать столбец IMAC 5 мл с 5 томов (CV) столбец привязки буфера (20 мм HEPES, рН 7,5, 500 мм NaCl, 10 мм имидазола) со скоростью потока с помощью жидкостной хроматографии (ПСОК) системы быстро белок 1 мл/мин. Загрузите отфильтрованные супернатант на столбец со скоростью потока 0,5 мл/мин. Промойте колонку с 5 резюме мыть буфера (20 мм HEPES, рН 7,5, 500 мм NaCl, 50 мм имидазола) со скоростью потока 1 мл/мин. Элюировать белка с 3 CV Элюирующий буфер (20 мм HEPES, рН 7,5, 500 мм NaCl, 350 мм имидазола) фракции 0,5 мл/мин собирать 1,5 мл со скоростью потока. Если доступно, выберите режим элюции вверх потока для повышения концентрации eluted белка. Идентифицировать фракции от Хроматограмма ПСОК, которые содержат протеин интереса SDS-PAGE и использовать стандартные методы для измерения концентрации белка5. Бассейн и сконцентрировать элюции фракций, содержащих высокий количество белка, используя устройство центробежного ультрафильтрации (MWCO 3 кДа, 5 мл) 2 мл. Центрифуга в 21000 g x, чтобы удалить любой преципитат и пройти через фильтр 0,22 мкм. Сбалансировать 120 мл размер исключения хроматографии (S) столбец с 2 CV S буфера (20 мм HEPES, 150 мм NaCl, pH 7.5, 0,5 мм TCEP) со скоростью потока 1 мл/мин с помощью ПСОК. Привнести концентрированных белков от 2.1.9 на столбец, а элюировать с 1 CV S буфера со скоростью потока 0,5 мл/мин, сбора фракций 1 мл. Выявления фракций, содержащих протеин интереса как раньше. Бильярд фракций, содержащих высокий белок суммы. Хранить при 4 ° C для краткосрочного использования, или добавить глицерин в 20% и хранить при температуре-80 ° C в небольших аликвоты. Очистка E-PRD белка с тегом His6 удален Следуйте инструкциям в 2.1.1-2.1.8 для очистки His6-меткой E-PRD белка. Бассейн пик фракций и определить концентрацию белка. Добавить табак etch протеазы вируса (TEV) (1 мг/мл) по 2 мкл/мг белка пула. Передача для диализа трубки (6 кДа) и dialyze в буфере S на ночь при 4 ° C. Этот шаг позволяет расщепления His6 тега и удаления имидазола, которая будет конфликтовать со связыванием в Ni-НТА смолу на следующем шаге. Сбалансировать 5 мл Ni-НТА смолы в столбце гравитации с 3 резюме S буфера. Слейте излишки буфер из смолы. Залейте рассеченного E-PRD белка на смолы и инкубировать 1 час на платформу качания позволить uncleaved His6-меткой E-PRD и рассеченного His6 тега привязки. Протеазы ТэВ также His6-тегами и будет привязать смолы. Собирать через поток, который содержит тег бесплатный E-PRD. Вымойте смолы с 2 CV S буфера, чтобы гарантировать все E-PRD восстанавливается. Концентрат E-PRD потока через по 2 мл с помощью центробежных ультрафильтрации устройство (MWCO 3 кДа, 5 мл). Центрифуга на 21 000 x g удалить любой преципитат и пройти через фильтр 0,22 мкм. Сбалансировать 120 мл S столбец с 2 CV S буфера (20 мм HEPES, 150 NaCl, pH 7.5, 0,5 мм TCEP MST или 20 мм трис-HCl, 1 DTT, pH 7 для ЯМР) со скоростью потока 1 мл/мин с помощью ПСОК. Привнести концентрированных белков E-PRD от 2.2.5 на столбец, а элюировать с 1 CV S буфера со скоростью потока 0,5 мл/мин, сбора фракций 1 мл. Выявления фракций, содержащих протеин интереса как раньше. Бильярд фракций, содержащих высокий белок суммы. Хранить при 4 ° C для краткосрочного использования, или добавить глицерин в 20% и хранить при температуре-80 ° C в небольших аликвоты. 3. ЯМР методы Подготовка образца ЯМР Очищайте 15N-меченых одичал типа или R1914E E-PRD белка как описывалось ранее, с помощью 20 мм трис-HCl, 1 DTT, рН 7 как S буфер для шага 2.2.6. Белка акций решения обычно варьируются в пределах от 0,3 до 1 мм с объемами около 1 мл.Примечание: Белка может быть сосредоточено на > 100 мкм с использованием MWCO 3 кДа, 5 мл центробежные ультрафильтрации устройство довести концентрацию в подходящий диапазон для пробоподготовки. Очищайте образец немеченого VimRod протеина используя 20 мм трис-HCl, 1 DTT, рН 7 как S буфер для шага 2.1.10. В окончательном объеме 500 мкл, добавить одичал тип или мутант E-PRD белка в конечной концентрации 100µM, окись дейтерия (D2O) до конечной концентрации 10% (v/v), и DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic кислота) до конечной концентрации 20 мкм. Принесите объем образца до 500 мкл с использованием 20 мм трис-HCl, 1 мм DTT, рН 7. Подготовка репрезентативной выборки описаны в таблице 4.Примечание: 0 ppm резонанс DSS используется для калибровки химических сдвигов 1H, а также для косвенных ссылок на 15N химические сдвиги белок6. D2O используется для блокировки сигнала дейтерия держать спектрометр, работающих на постоянном магнитном поле чистой. Составляют второй образец E-PRD, Д2O и DSS, как и предыдущий шаг и добавьте VimRod в конечной концентрации 50 мкм до чего объемом до 500 мкл. Передать 500 мкл образцы 5 мм широкий пробирки для NMR для эксперимента. Экспериментальная установка ЯМР Включите воздушного потока с извлечь команду «Эдж»; Это будет воспитывать образца от магнита. Теперь поместите образец в spinner поверх магнита, открытия и вставьте с командой «ij». Подождите, пока образец располагается внутри магнита перед продолжением. Создание нового набора данных с помощью команды «edc» и загрузить стандартные 1H ЯМР параметры, выбрав эксперимент «ZGPR» (рис. 1). Заполните имя, поля PROCNO (номер папки обработанных данных) и EXPNO (эксперимент номер). Выберите растворителя в поле «Набор растворителя» и нажмите на «Execute «getprosol»», чтобы прочитать параметры зависит от растворителя (prosol) и стандартных probehead. Замок образец транс растворителей, т.е., D2O, с помощью команды «блокировка» и подождите, пока он закончен Подметальные и достигает блокировки. Исправьте частоты резонанса магнита, тюнинг образца с помощью автоматической настройки команды «Атма». Контролировать колебания кривой до завершения автоматической настройки. Оболочку магнитного поля с помощью TOPSHIM (команда «topshim»). Шиммирования — процесс изменения магнитного поля для достижения единообразия вокруг образца. Это хорошая практика для хранения значений ШИМ с командой «wsh» и прочитать их с помощью «rsh» перед topshim, при использовании же или аналогичные образцы. Настройка усиления приемника с помощью команды «ПГА» для достижения максимальной соотношение сигнал-шум. Поместите центр спектра на смещение воды резонанс (o1) и задайте Протон пульс 90 градусов (p1) при высокой мощности, используя «calibo1p1». Собирать Протон спектра с помощью нулевого идти процесса с «efp», которая включает в себя экспоненциального умножения («ет»), спад свободной индукции (FID) включения расширения линии, «ft» и команда «ЖГ» преобразование Фурье FID и «pk», чтобы применить фазы Коррекция. Примените автоматический фаза коррекции «АПК» и автоматическая коррекция базовой линии «АБСН» с помощью многочлена без вариант интеграции. Создайте новый набор данных (как в 3.2.2) для эксперимента SOFAST HMBC, выбрав «SFHMQC3GPPH» в эксперименте. Копия оптимизирован P1 и O1 из спектра Протон и заполнения P1 зависит от импульсов с помощью команды «getprosol 1H p1 plw1», где p1 — это оптимизированная значение P1 и plw1 уровень мощности для P1. Оптимизировать константа CNST54 установить смещение для Амида химический сдвиг и CNST55 для определения пропускной способности для того, чтобы охватить спектральный областей интереса, который позволяет усиления приемника, чтобы быть оптимизированы (рис. 2). Чтобы выбрать эти параметры, извлечь первый FID (спад свободной индукции) из двумерных спектра и найдите наблюдаемых сигнала для их определения. Кроме того различаются релаксации задержки (D1), количество проверок (NS) и Макетные сканирования (DS) для получения приемлемого сигнал чувствительности с командой «gs», которая позволяет идти и сканирования для контроля качества данных в режиме реального времени. Запишите спектры с использованием нуля идти «ЖГ». Обработка данных ЯМР Задайте параметры обработки размер прямого F2 (1H) и косвенные F1 (15N) размеры с помощью спектра «SI F2 = 2048, F1 = 512» с Факультативным линейное предсказание в косвенные измерения (рис. 3). Выберите «QSINE» как функции окна и введите синус Белл сдвиг (SSB) 2 для обработки двумерных спектра. Введите команду «xfb» для обработки данных в обоих направлениях с окна функция и Фурье преобразованием. Используйте команду «apk2d» для выполнения автоматического фаза коррекции в обоих направлениях. Если автоматический процесс не достичь удовлетворительного уровня фаза коррекции, экстракт FIDs с командой «rser», рассчитать значения фазы 1D обработка и применить их к 2D данных. Измените базовый с функцией коррекции Автоматическое вычитание базовой линии «abs2» для 2D-данных. Это применяется полиномиальная функция между ppm значения, определенные в параметрах обработки и будет производить 2D спектра для дальнейшего анализа. Если планирование для выполнения последовательной обработки для сравнения данных взаимодействия с другой молекулой, хранить параметры обработки с командой «wpar» и вызывать их с «ЭОНР». Таким образом, все наборы данных будут обрабатываться с же параметры и варианты будут вводиться не из-за обработки различия. Анализ данных ЯМР Введите команду «pp» начать процесс сбора пик. Определите ppm диапазона и минимальная интенсивность/максимальное количество вершин, на основе ожидаемого пика (рис. 4). Нажмите на кнопку ОК и проверьте результаты путем визуального осмотра. При необходимости, повторите этот процесс до тех пор, пока результаты являются удовлетворительными, базируясь на спектры качества. Создание peaklist с командой «РР».Примечание: Этот peaklist содержит сведения о данных высота/пика интенсивности по умолчанию и могут быть экспортированы в последующих спектров и могут быть прочитаны другими программами. Наблюдаете изменения в интенсивности пик или движения в химически переносы в спектры HSQC белка, определяющие взаимодействие с другой молекулой. Если взаимодействующие молекула является большой, ожидаете сокращения пиковых значений силы наряду с исчезновением некоторых вершин. Импортируйте список пик на следующий набор данных, щелкнув на закладке «пики» и выбрав команду «Импорт» с правой кнопкой мыши в окне пиков. Визуализировать вершины над спектра и, если необходимо перенести их на новые позиции. Нажмите на «сброс интенсивности» для «полной таблицы» для создания peaklist для спектра с интенсивностью (рис. 5). Этот список пик будут перенесены данные позиции из списка хранимых пик. Экспорт списков пик из различных наборов данных в электронную таблицу или другие математические программы для анализа, выбрав функцию «Экспорт». Расчет изменения в интенсивности пик с функцией «пика интенсивности в сложных спектра/пика интенсивности в спектре белка» для каждого пика. Значения могут быть преобразованы в процентах путем умножения 100. Обратите внимание, что пик тома также являются полезными, хотя пика интенсивности проще для измерения пиков, которые расположены близко друг к другу, как это обычно бывает для белков с высокой плотностью относительно широкой пиков. 4. микромасштабной Thermophoresis (MST) Подготовка лигандом белка E-PRD Обмен лиганд в MST совместимый буфер dialyzing до 800 мкл белка в мини-диализа 3.5 кДа, приостановлено в 1 Л 20 мм HEPES, рН 7,5, 10 мм NaCl, помешивая медленно при температуре 4 ° C на ночь. Концентрат лиганда с помощью центробежных ультрафильтрации (3 кДа MWCO) центрифугированием на 14 000 x g 10 мин передачи концентрированных белков в чистой трубку. Центрифуга лиганд в 21 000 x g 10 мин и тщательно передать новой трубки для удаления осажденный белки супернатант. Определить концентрацию лиганда с помощью поглощения в 280 Нм и коэффициент вымирания лиганда. Добавить 10% Tween-20 дать окончательный 0,015% концентрации. Tween-20 добавляется в Пробирной буфер для предотвращения адсорбции капилляров. Окончательный анализ буфера, который используется для экспериментов MST-20 мм HEPES, рН 7,5, 10 мм NaCl, 0,015% Tween-20. Подготовка красителя меченых целевого белка VimRod Воссоздать краска красно трис НТА, добавляя 50 мкл 1 x, указанный PBS-T с красно трис НТА дать в концентрации 5 мкм. Обойтись в 200 мкл пробирки 2 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C. Разбавьте целевого белка до 0,34 мкм с аналитического буфера. Добавьте 58 мкл цели 2 мкл Алиготе красно трис НТА красителя и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация краситель меченых цели — 0,33 мкм. Центрифуга обозначенные цели на 21 000 x g 10 мин и тщательно передать новой трубки для удаления любой преципитат супернатант. Краситель красный трис НТА связывается с белками через тег His6 и имеет Константа диссоциации привязки (DK) в суб наномолярных диапазоне. Это фактически 100% обязан целевого белка, так что без дальнейших очистки требуется. Включите инструмент MST и откройте программное обеспечение управления. Выберите параметр красный краситель красный трис НТА. Включите контроль температуры до 25 ° C. Выберите предтестовая для проверки маркировки целевого и проверьте для агрегирования или адсорбции кюветы. Оценки этих параметров предоставляется автоматически. Mix 17 мкл аналитического буфера и 3 мкл целевого белка и микс, закупорить. Заполните два стандартных капилляров путем погружения их в разреженных целевой и составление жидкость в центр капилляра. Место капилляров в лотке и в инструменты. Старт измерения. Просмотрите результаты ищет достаточный уровень флюоресценции и никаких признаков адсорбции (искажения в форме капиллярной линии) или агрегации (искажения в трассировке MST), которые будут отмечены в анализ программного обеспечения. Если результаты являются позитивным шагом к лигандом шаги, если не различные буфера должен быть судим или количество Tween-20 может быть увеличено до 0,05% или выше. Подготовка два раза разрежения серии E-PRD лиганда Подготовить серию разрежения, снабдив 16, 200 мкл трубки из 1-16. Добавьте 17 мкл лиганд в 1.17 x большей концентрации, чем концентрация максимальный лиганд, желал Tube1. Этот объем является дважды необходимое количество (8,5 мкл) как Алиготе будет затем передан следующей трубы в серии. Окончательный объем assay настолько 10 мкл до 1 x 8,5 мкл 1,17 x концентрации лиганда будет разбавлена добавлением 1,5 мкл целевого белка, VimRod. Эта максимальная концентрация выбрали должно быть по крайней мере 20 раз расчетное значение KD . Добавьте в Tubes2-16, используя новый наконечник пипетки для каждого Алиготе 8.5 мкл аналитического буфера. Повторное использование наконечники могут повлиять на точность (для консультации по точного дозирования см с инструкциями производителя). Передача 8.5 мкл лигандом от Tube1 до Tube2 медленно выпускать решения в assay buffer без формирования пузырьков. Смешайте лиганда и буфера, закупорить вверх и вниз по крайней мере 6 раз, опять же без формирования пузырьков. E-ПДР в наиболее концентрированным трубка была 1,5 мм и помечены VimRod присутствовал на заключительном концентрации 50 Нм. Передавать 8.5 мкл лиганда с Tube2 на Tube3 и смешать с аналитического буфера. Повторите серийный разбавления до тех пор, пока все трубы имели лигандом добавил. Отменить 8,5 мкл от Tube16, так что все трубы содержат 8,5 мкл лиганд в серию разведений два раза. Подготовка обязательной реакции и MST эксперимента Добавить 1,5 мкл помечены целевого белка в каждой из трубок и смешайте нежно закупорить вверх и вниз, стараясь избежать пузырей. Инкубируйте 15 мин. Выберите режим эксперта для привязки пробирного и введите в параметрах серию последовательных разрежения. Убедитесь, что регулятор температуры установлен до 25 ° C, мощность возбуждения имеет значение 40% и власть MST до среднего. Эти параметры должны быть оптимизированы для других партнеров привязки изучается. Заполните капилляров с реакции связывания и место в капиллярной лоток. Загрузить лоток в инструмент, ждать температуры восстановить 25 ° C и начать измерение. Анализ данных Откройте файл пробирного привязки в программное обеспечение для анализа сходства. Обзор капиллярного сканирования; Флуоресценции уровни не должны варьироваться более чем на 10% от среднего, не агрегации или адсорбции должно быть обнаружено, как описано в разделе 3.6. Выберите анализ MST на правой панели и перетащите пробирного данных в наборе анализа. Если существует несколько запусков же цель лиганд привязки assay при одинаковых условиях они могут быть объединены путем перетаскивания в одном наборе. Кроме того каждый запуск может быть удален в анализ самостоятельно. Перейдите на вкладку дозы ответ подходят для графа данных. Выберите модель KD , если ожидается одной привязки сайта. Хилл модель также является вариантом для нескольких сайтов связывания с совместных поведение. Останец точки, которые не прошли контроль качества могут быть удалены из fit на данном этапе. Слияние наборов с несколько анализов будет среднем и ошибки рассчитываются как стандартное отклонение. Откройте вкладку окончательный и сравнить результаты всех участков на одном графике. Получить результаты установки для каждой кривой из таблицы, которая создается. Экспортируйте данные или кривых в другие презентации или анализ программного обеспечения, при необходимости.