Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

1. espressione recombinant della proteina Espressione di Envoplakin PRD (E-PRD) e il Vimentin 99-249 (VimRod) Trasformare le cellule di e. coli BL21 (DE3) con il plasmide contenente il gene desiderato. Diffondere le cellule su piastre di agar contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Scegli una singola Colonia e inoculare 20 mL di brodo formidabile (TB) contenente 100 ampicillina µ g/mL per selezionare per il plasmide. Far crescere la cultura a 37 ° C con agitazione (180 giri/min) durante la notte. Trasferire la cultura intera da 20 mL a 1 L di TB contenente ampicillina di 50 µ g/mL. Incubare la coltura a 37 ° C con agitazione a 180 giri/min fino a quando il OD600 = 0.6-0.8. Ridurre la temperatura a 18 ° C e indurre l’espressione della proteina aggiungendo isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM. Continuare incubazione a 18 ° C con agitazione a 160 giri/min durante la notte per consentire l’espressione della proteina. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione la cultura a 8.000 x g per 15 min. decantare e scartare il surnatante. Lavare le cellule prelevate da risospendere il pellet cellulare in circa 40 mL di fosfato soluzione salina tamponata (PBS: tampone fosfato 20 mM, pH 7.4, 120 mM NaCl). Trasferire la risospensione in una provetta 50 mL. Centrifugare nuovamente a 8.000 x g per 15 min. Decantare e scartare il surnatante. Immediatamente iniziare il protocollo di purificazione o congelare il pellet di cellule a-20 ° C per un uso futuro. Espressione della proteina isotopicamente etichettata Trasformare le cellule di e. coli BL21 (DE3) e preparare una coltura starter 20 mL come in 1.1.1-1.1.2. Trasferire la cultura intera da 20 mL a 1 L di TB arricchito contenente un tryptone ulteriore g 4,0, 5,0 g NaCl e 100 µ g/mL ampicillina. Incubare la coltura a 37 ° C con agitazione a 160 giri/min fino a quando il OD600 = 1.6-1.9. La cultura di 1 L di raccolta mediante centrifugazione a 8000 x g per 15 min. decantare e scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare da Risospendere delicatamente in circa 40 mL di PBS e trasferire la risospensione in un tubo da 50 mL. Centrifugare nuovamente a 8.000 x g per 15 min. decantare e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di media minimi M9 (tabella 1) e trasferimento al resto del 950 mL di media minimi M9 contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Aggiungere 50 mL di miscela nutriente filtro sterilizzato (tabelle 2 e 3). Acclimatare la cultura a 18 ° C per 30 min prima dell’aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM. Incubare per una notte a 18 ° C con agitazione a 160 giri/min. Raccogliere le cellule come nella sezione 1.1.4-1.1.6. 2. purificazione di cromatografia (IMAC) di affinità del metallo di VimRod ed E-PRD immobilizzato Purificazione di His6-Tag VimRod Risospendere il pellet cellulare in 5 mL/g di PBS contenente un inibitore di proteasi cocktail EDTA carente. Omogeneizzare con 12 colpi in un omogeneizzatore del tessuto lisata per migliorare la lisi delle cellule nel passaggio seguente. Su ghiaccio, Sonicare sospensione delle cellule ad un impulso di 1 s su/1 s off, ampiezza di 80% per un totale di 1,5 min. Ripetere la sonicazione altre due volte, agitando delicatamente il ghiaccio tra le esecuzioni per evitare il surriscaldamento. Centrifugare il campione a 75.000 x g per 45 min. decantare e filtrare il surnatante utilizzando un filtro per siringa (0,45 µm). Equilibrare una colonna IMAC 5ml con 5 volumi di colonna (CV) del buffer obbligatorio (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazolo 10 mM) con una portata di 1 mL/min utilizzando un sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci. Caricare il surnatante filtrato sulla colonna ad una portata di 0,5 mL/min. Lavare la colonna con 5 CV di lavare buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazolo di 50 mM) con una portata di 1 mL/min. Eluire la proteina con 3 CV del tampone di eluizione (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazolo 350 mM) ad un flusso di frazioni di 0,5 mL/min raccogliere 1,5 mL. Se disponibile, selezionare la modalità getto eluizione per aumentare la concentrazione delle proteine eluite. Identificare le frazioni dal cromatogramma FPLC che contengono la proteina di interesse da SDS-PAGE e utilizzare metodi standard per misurare la concentrazione di proteina5. Piscina e le frazioni di eluizione che contengono le quantità elevate di proteina usando un dispositivo centrifugo ultrafiltrazione (kDa MWCO 3, 5ml) a 2 mL di concentrato. Centrifugare a 21.000 x g per rimuovere qualsiasi precipitato e passare attraverso un filtro di 0,22 μm. Equilibrare una colonna di cromatografia (S) esclusione dimensioni 120 mL con 2 CV di S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP) ad un flusso di 1 mL/min utilizzando un FPLC. Iniettare il concentrato della proteina da 2.1.9 sulla colonna ed eluire con 1 tampone di CV di S ad una portata di 0,5 mL/min, raccogliendo frazioni di 1 mL. Identificare le frazioni contenenti la proteina di interesse come prima. Piscina le frazioni contenenti la proteina di importi più elevata. Conservare a 4 ° C per uso a breve termine o aggiungere glicerolo al 20% e conservare a-80 ° C in piccole aliquote. Purificazione della proteina E-PRD con l’etichetta His6 rimosso Seguire i passaggi in 2.1.1-2.1.8 per purificare la proteina His6-etichetta E-PRD. Piscina le frazioni di picco e determinare la concentrazione di proteina. Aggiungere il tabacco etch proteasi virus (TEV) (1 mg/mL) a 2 µ l/mg di proteina in pool. Trasferimento a dialisi tubi (6 kDa) e Dializzare nel buffer di S durante la notte a 4 ° C. Questo passaggio consente di clivaggio del tag His6 e rimozione dell’imidazolo che interferisca con l’associazione alla resina Ni-NTA nel passaggio successivo. Portare i 5 mL di resina Ni-NTA in una colonna di gravità con 3 CV di S buffer. Tampone in eccesso di scarico dalla resina. Versare la proteina E-PRD spaccata sulla resina e incubare per 1 ora su una piattaforma a dondolo per consentire l’ApoAlert His6-etichetta E-PRD e il tag di His6 spaccato da associare. La proteasi TEV è anche His6-etichetta e volontà di associare la resina. Raccogliere il flusso attraverso, che contiene il tag-gratuita E-PRD. Lavare la resina con 2 CV di S buffer per garantire tutti i E-PRD è recuperato. Concentrarsi E-PRD nel flusso attraverso a 2 mL utilizzando un dispositivo centrifugo ultrafiltrazione (kDa MWCO 3, 5ml). Centrifugare a 21 000 x g per rimuovere qualsiasi precipitato e passare attraverso un filtro di 0,22 μm. Equilibrare una colonna 120 mL S con 2 CV di S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP per MST o 20 mM Tris-HCl, 1 millimetro DTT, pH 7 per NMR) ad un flusso di 1 mL/min utilizzando un FPLC. Iniettare il concentrato della proteina E-PRD da 2.2.5 sulla colonna ed eluire con 1 tampone di CV di S ad una portata di 0,5 mL/min, raccogliendo frazioni di 1 mL. Identificare le frazioni contenenti la proteina di interesse come prima. Piscina le frazioni contenenti la proteina di importi più elevata. Conservare a 4 ° C per uso a breve termine o aggiungere glicerolo al 20% e conservare a-80 ° C in piccole aliquote. 3. NMR metodi Preparazione del campione NMR Purifica i 15N-labeled selvaggio-tipo o proteina di R1914E E-PRD come descritto in precedenza utilizzando 20 mM Tris-HCl, 1 millimetro DTT, pH 7 come il buffer di S per passaggio 2.2.6. Soluzioni di riserva di proteine, solitamente vanno da 0,3 a 1 mM con volumi di circa 1 mL.Nota: Proteina possa essere concentrata a > 100 µM utilizzando un kDa MWCO 3, 5ml centrifugo ultrafiltrazione dispositivo per portare la concentrazione in una gamma adatta per la preparazione del campione. Purificare un campione della proteina di VimRod senza etichetta utilizzando 20 mM Tris-HCl, 1 millimetro DTT, pH 7 come il buffer di S per passaggio 2.1.10. In un volume finale di 500 µ l, aggiungere wild-type o mutante della proteina E-PRD a una concentrazione finale di 100 µm, ossido di deuterio (D2O) a una concentrazione finale di 10% (v/v) e di DSS (acido 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic) a una concentrazione finale di 20 µM. Bring il volume del campione fino a 500 µ l utilizzando 20 mM Tris-HCl, 1 millimetro DTT, pH 7. Una preparazione del campione rappresentativo è descritta nella tabella 4.Nota: 0 ppm risonanza del DSS è usato per calibrare gli spostamenti chimici 1H così come per il riferimento indiretto del prodotto chimico 15N sposta delle proteine6. D2O è utilizzato per il segnale di blocco di deuterio per mantenere lo spettrometro operante a un campo magnetico netto costante. Portare un secondo campione di E-PRD, D2O e DSS come nel passaggio precedente e aggiungere VimRod a una concentrazione finale di 50 µM prima di portare il volume fino a 500 µ l. Trasferire i campioni µ l 500 a un tubi NMR ampia di 5 mm per l’esperimento. Setup sperimentale NMR Attivare il flusso d’aria con il comando di espulsione “ej”; verrà visualizzata l’esempio dal magnete. Ora, posto il campione all’interno di una casella di selezione sopra il magnete dall’apertura e inserire con il comando “ij”. Attendere che il campione si deposita all’interno del magnete prima di procedere. Creare un nuovo dataset utilizzando il comando “edc” e caricare i parametri standard 1H NMR selezionando esperimento “ZGPR” (Figura 1). Compilare i campi nome, EXPNO (esperimento numero) e PROCNO (numero di cartella di dati trattati). Selezionare il solvente nel campo “Imposta solvente” e clicca su “Execute ‘getprosol'” per leggere probehead standard e parametri dipendenti dal solvente (prosol). Bloccare il campione al deuterati solvente, vale a dire, D2O, utilizzando il comando “blocca” e attendere fino a quando è finito spazzare e raggiunge blocco. Correggere la frequenza di risonanza del magnete di tuning l’esempio utilizzando il comando Sintonizzazione automatico “atma”. Monitorare la curva di oscillazione fino al termine della sintonizzazione automatica. Il campo magnetico usando TOPSHIM (comando “topshim”) di spessore. Spessoramento è processo di aggiustamenti al campo magnetico per ottenere uniformità intorno al campione. È buona norma per memorizzare i valori di spessore con il comando “wsh” e leggerli con “rsh” prima di topshim, se usando i campioni uguali o simili. Regolare il guadagno del ricevitore con comando “rga” per raggiungere il massimo rapporto segnale-rumore. Posizionare il centro dello spettro sull’offset della risonanza di acqua (o1) e impostare l’impulso di protoni (p1) di 90 gradi ad alta potenza utilizzando “calibo1p1”. Raccogliere lo spettro del protone usando lo zero andare processo con “efp” che comprende la moltiplicazione esponenziale (“em”), free induction decay (FID) che incorporano allargamento di riga, “ft” e “zg” comando trasformazione del fourier di FID e “pk” per applicare la fase correzione. Applicare la correzione automatica di fase “apk” e la correzione automatica linea di base “absn” utilizzando il polinomio senza opzione di integrazione. Creare un nuovo dataset (come 3.2.2) per l’esperimento SOFAST HMBC selezionando “SFHMQC3GPPH” nell’esperimento. Copia ottimizzata P1 e O1 dallo spettro del protone e popolare P1 dipendenti impulsi utilizzando il comando “getprosol 1h p1 plw1”, dove p1 è il valore di P1 ottimizzato e plw1 è il livello di potenza per P1. Ottimizzare la costante CNST54 per impostare l’offset per spostamento chimico ammide e CNST55 per definire la larghezza di banda al fine di comprendere le regioni spettrali di interesse che permette il guadagno del ricevitore essere ottimizzato (Figura 2). Per selezionare questi parametri, estrarre il primo FID (decadimento libero induzione) dallo spettro bidimensionale e cercare il segnale osservato per definirli. Inoltre, variare il ritardo di rilassamento (D1), numero di scansioni (NS) e fittizi scansioni (DS) per ottenere la sensibilità del segnale accettabile con il comando “gs”, che consente di andare e scansione per monitorare la qualità dei dati in tempo reale. Registrare gli spettri con Zero Go “zg”. Elaborazione dati NMR Impostare i parametri di elaborazione per la dimensione della F2 diretto (1H) e indiretta F1 (15N) dimensioni del spettro utilizzando “SI F2 = 2048, F1 = 512” con opzionale predizione lineare nella dimensione indiretta (Figura 3). Selezionare “QSINE” come la funzione di finestra e immettere uno spostamento di bell Sine (SSB) di 2 per elaborare lo spettro bidimensionale. Immettere il comando “xfb” per elaborare i dati in entrambe le direzioni con trasformazione di funzione e trasformata di fourier di finestra. Utilizzare il comando “apk2d” per eseguire la correzione automatica di fase in entrambe le direzioni. Se il processo automatico non raggiunge un livello soddisfacente di correzione di fase, estrarre FIDs con il comando “rser”, calcolare i valori di fase dall’elaborazione 1D e applicarli ai dati 2D. Correggere la linea di base con la funzione di correzione automatica linea di base “abs2” per dati 2D. Questo si applica una funzione polinomiale tra ppm valori definiti nei parametri di elaborazione e produrrà uno spettro 2D per ulteriori analisi. Se si prevede di eseguire l’elaborazione seriale per il confronto di dati di interazione con un’altra molecola, memorizza i parametri di elaborazione con il comando “wpar” e richiamarli con “rpar”. In questo modo che tutti i set di dati saranno trattati con stessi parametri e le variazioni non verrà introdotto a causa di differenze di elaborazione. Analisi dei dati NMR Immettere il comando “pp” per iniziare il processo di picking di picco. Definire il numero di intensità/massima gamma e minimo del ppm di picchi in base ai previsti picchi (Figura 4). Fare clic su OK e verificare i risultati mediante ispezione visiva. Se necessario, eseguire nuovamente il processo fino a quando i risultati sono soddisfacenti basato su qualità di spettri. Generare un peaklist con il comando “pp”.Nota: Questo peaklist contiene dati altezza/picco intensità informazioni per impostazione predefinita e possono essere esportati in spettri successivi e possono essere letti da altri programmi. Osservare le modifiche nelle intensità di picco o movimento in spostamenti chimici negli spettri HSQC proteine che indicano l’interazione con un’altra molecola. Se la molecola interagente è grande, è possibile aspettarsi riduzioni delle intensità di picco insieme a scomparsa di alcune vette. Importare l’elenco di picco per il prossimo set di dati facendo clic sulla scheda “picchi” e selezionando “importazione” con un clic destro nella finestra picchi. Visualizzare le cime sopra lo spettro e se necessario spostare loro in nuove posizioni. Clicca su “reset intensità” per “tabella completa” per generare un peaklist per lo spettro con intensità (Figura 5). Questo elenco di picco riporto le informazioni di posizione dall’elenco stored picco. Esportare gli elenchi di picco da diversi set di dati in un foglio di calcolo o altro programma di matematico per l’analisi selezionando la funzione “Esporta”. Calcolare la variazione delle intensità di picco con la funzione “intensità di picco in intensità di complesso spettro/picco nello spettro di proteina” per ogni picco. I valori possono essere convertiti alla variazione percentuale da moltiplicazione di 100. Si noti che picchi di lavoro sono anche utili, anche se l’intensità di picco sono più facili da misurare per cime che sono posizionati vicino a vicenda, come sono solitamente il caso per le proteine con un’alta densità di picchi relativamente ampie. 4. su microscala submicronica (MST) Preparazione del ligando E proteina-PRD Scambiare il ligand in un buffer compatibile MST di dialisi fino a 800 μL di proteina in un’unità di mini-dialisi 3,5 kDa sospesa in 1 L di 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, mescolando lentamente a 4 ° C durante la notte. Concentrare il ligando utilizzando un’unità di ultrafiltrazione centrifugo (3 kDa MWCO) mediante centrifugazione a 14 000 x g per 10 min trasferimento proteine concentrate in una provetta pulita. Centrifugare il ligando a 21.000 x g per 10 min e attentamente trasferire il surnatante in una provetta nuova per rimuovere qualsiasi proteina precipitata. Determinare la concentrazione del ligando utilizzando l’assorbanza a 280 nm e il coefficiente di estinzione ligando. Aggiungere 10% Tween-20 per ottenere una concentrazione finale di 0,015%. Tween-20 è aggiunto il buffer di analisi per impedire l’adsorbimento non specifico ai capillari. Il tampone del saggio finale che viene utilizzato per gli esperimenti di MST è 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 0.015% Tween-20. Preparazione di tingere-contrassegnati Target della proteina VimRod Ricostituire il colorante rosso-tris-NTA aggiungendo 50 μL di 1X PBS-T in dotazione con il rosso-tris-NTA dare una concentrazione di 5 μM. Pipettare 2 aliquote del μL nei tubi di 200 μL e conservare a-20 ° C. Diluire la proteina dell’obiettivo a 0,34 μM con tampone del saggio. Aggiungere 58 μL di destinazione ad un’aliquota di 2 μL di colorante rosso-tris-NTA e incubare per 30 min a temperatura ambiente. La concentrazione finale di destinazione tingere-contrassegnati è 0,33 μM. Centrifugare il contrassegnati dell’obiettivo a 21.000 x g per 10 min e attentamente trasferire il surnatante in una provetta nuova per rimuovere qualsiasi precipitato. Il colorante rosso-tris-NTA si lega alle proteine tramite il tag His6 e ha una costante di dissociazione di legame (KD) nella gamma sub-nanomolari. È efficace al 100% associato alla proteina bersaglio quindi nessun ulteriore purificazione è necessaria. Accendere lo strumento MST e aprire il Software di controllo. Selezionare l’impostazione di rosso per il colorante rosso-tris-NTA. Attivare il controllo della temperatura a 25 ° C. Il pre-test per convalidare l’etichettatura del bersaglio e visualizzate per aggregazione o adsorbimento per la cuvette. Una valutazione di questi parametri viene fornita automaticamente. 17 mix μL di tampone del saggio e 3 µ l di proteina bersaglio e mescolare pipettando. Riempire due capillari standard immergendoli nella destinazione diluita e aspirare il liquido al centro del capillare. Posizionare i capillari nel vassoio e negli strumenti. Avviare la misurazione. Esaminare i risultati alla ricerca di un livello sufficiente di fluorescenza e nessun segno di adsorbimento (distorsione nella forma di capillare) o l’aggregazione (distorsioni nella traccia MST) che verrà contrassegnata in software di analisi. Se i risultati sono positivo mossa verso il ligando passaggi, se non un buffer diversi deve essere provato o la quantità di Tween-20 può essere aumentata a 0.05% o superiore. Preparazione della serie di diluizioni di ligando E-PRD Preparare una serie di diluizioni di etichettatura 16, 200 tubi μL da 1-16. Aggiungere 17 μL del ligando a 1.17 x una maggiore concentrazione rispetto alla concentrazione di ligando massimo desiderata di 1. Questo volume è due volte la quantità necessaria (8,5 μL) come un’aliquota sarà quindi trasferita al tubo successivo nella serie. Il volume finale del dosaggio è 10 μL quindi 8,5 μL di 1,17 concentrazione del ligando saranno diluiti a 1 x tramite l’aggiunta di 1,5 μL della proteina bersaglio, VimRod. Questa concentrazione massima scelta deve essere almeno 20 volte il valore di KD stimato. Aggiungere il 8,5 μL di tampone Tubes2-16 utilizzando un nuovo puntale per ogni aliquota. Riutilizzare i puntali per pipette possono influenzare l’accuratezza (per consulenza accurata pipettaggio Vedi istruzioni). Trasferire 8,5 µ l di legante da 1 a Tube2 rilasciando lentamente la soluzione nel buffer di analisi senza generare bolle. Mescolare il buffer e ligando pipettando su e giù almeno 6 volte, senza generare bolle. Il PRD E nel tubo più concentrato era 1,5 mM e la VimRod con etichetta era presente ad una concentrazione finale di 50 nM. Trasferire 8,5 µ l di legante da Tube2 a Tube3 e mescolare con il tampone. Ripetere la diluizione seriale fino a quando tutti i tubi hanno avuto ligando aggiunto. Scartare 8.5 μL da Tube16 modo che tutti i tubi contengono 8,5 μL di ligand in una serie di diluizioni. Preparazione dell’esperimento reazione vincolanti e MST Aggiungere 1,5 μL della proteina contrassegnati dell’obiettivo per ciascuna delle provette e mescolare delicatamente pipettando su e giù facendo attenzione a evitare bolle. Incubare per 15 min. Selezionare la modalità esperto per l’analisi di associazione e immettere i parametri per una serie di diluizioni seriali. Assicurarsi che sia impostato il controllo della temperatura a 25 ° C, il potere di eccitazione è impostato su 40% e il potere di MST di mezzo. Questi parametri devono essere ottimizzati per gli altri partner di associazione in fase di studio. Riempire i vasi capillari con le reazioni di associazione e posizionare nel cassetto del capillare. Caricare il vassoio nello strumento, attendere che la temperatura di riprendere il 25 ° C e avviare la misurazione. Analisi dei dati Aprire il file di analisi di associazione del software di analisi di affinità. Rivedere le scansioni capillare; Livelli di fluorescenza non devono variare di oltre il 10% dalla media, nessuna aggregazione o adsorbimento dovrebbe essere rilevato come descritto nella sezione 3.6. Selezionare l’analisi di MST sul pannello destro e trascinare i dati di analisi nell’analisi impostato. Se esistono più esecuzioni della stessa analisi di associazione di destinazione-ligando in condizioni identiche possono essere unite facendo cadere nello stesso set. In alternativa, ogni esecuzione può essere eliminato in analisi in modo indipendente. Passare alla scheda Dose risposta adatta per rappresentare graficamente i dati. Scegli il modello KD se si prevede che un sito di legame singolo. Il modello di Hill è anche un’opzione per più siti di legame con comportamento cooperativo. Punti di valore erratico che non hanno superato il controllo di qualità possono essere rimosso dal fit in questa fase. Set di Unione con saggi multipli saranno mediati ed errori calcolati come la deviazione standard. Aprire la scheda finale e confrontare i risultati tra tutte le trame in un unico grafico. Recuperare i risultati di raccordo per ogni curva della tabella che viene generato. Esportare i dati o le curve componibile ad altri software di presentazione o analisi se lo si desidera.