用核磁共振 (nmr) 和微尺度热能 (mst) 测量球状和丝状蛋白的相互作用

1. 重组蛋白的表达 珠三角 (e-prd) 和 vimentin 99-249 (Vimentin) 的表达 用含有所需基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) 细胞。将细胞分散在含有100μgml 氨匹西林的琼脂板上。在37°c 条件下隔夜培育板材。 选择一个单一的菌落, 并接种20毫升的非常肉汤 (tb) 含有100μgml 氨匹西林选择质粒。在37°c 下生长培养, 摇一摇 (180 转/分) 过夜。 将整个20毫升培养物转移到含有50μgml 氨匹西林的结核病1升。在37°c 下培养培养, 在180转/分的情况下晃动, 直到 od600 = 0.6-0.8。 将温度降低到 18°c, 并通过将异丙基β-d-1-硫代丙醇 (iptg) 添加到 1 mm 的最终浓度, 诱导蛋白质表达。在18°c 下继续孵育, 夜间在160转/分的情况下晃动, 以允许蛋白质表达。 以 8, 000 x 克的速度将培养物离心 15分钟, 并丢弃上清液, 以收获细胞。 将细胞颗粒重新悬浮在约40毫升的磷酸盐缓冲盐水中 (pbs:20 mm 磷酸盐缓冲液, ph 值 7.4, 120 mm ncl), 将收获的细胞颗粒重新悬浮在一起。将重新悬浮液转移到50毫升管。再次以 8, 000 x g 离心15分钟。 欺骗和丢弃上清液。立即开始纯化协议, 或将细胞颗粒冻结在-20°c, 以备将来使用。 异种标记蛋白的表达 转化大肠杆菌BL21(DE3) 细胞, 并准备一个20毫升的启动培养, 如在 1.1.1-1.1.2。 将整个20毫升培养物转移到富集结核病的1升, 其中含有额外的 4.0 g 色氨酸、5.0 g 氯化碳和100μgml 氨匹西林。在37°c 下培养培养, 在160转/分的晃动下, 直到 od600 = 1.6-1.9。 以 8000 x 克离心 15分钟, 收获1升培养物, 并丢弃上清液。 将细胞颗粒轻轻再悬浮在大约40毫升的 pbs 中, 并将重新悬浮液转移到50毫升管中。 再次离心以 8, 000 x 克15分钟的时间, 分解和丢弃上清液。 将细胞颗粒在 mL 最小介质的20毫升中重新应用 (表 1), 并转移到含有100μgml 氨匹西林的 mL 最小介质的 950 ml 的剩余介质中。 加入50毫升的过滤灭菌营养混合物 (表2和表 3)。 将培养物适应 18°c 30分钟, 然后将 iptg 添加到 1 mm 的最终浓度中。 在18°c 下过夜, 在160转/分的情况下晃动。 收获细胞, 就像在 1.1.4-1.1.6 的部分。 2. 固定化金属亲和色谱 (imac) 对维姆罗德和 e-prd 的纯化 h6 标记的维姆罗德的纯化 在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的 pbs 中, 重新使用细胞颗粒, 而不是 edta。在 d盎司组织均质机中进行12笔同质化, 以改善细胞裂解的后续步骤。 在冰上, 以 1 ‘ s 关闭的脉冲将细胞悬浮声发出, 振幅为 80%, 共1.5 分钟. 再重复两次声纳, 在冰上的运行之间轻轻旋转, 以防止过热。 以 75, 000 x 克离心样品 45分钟, 用注射器过滤器 (0.45μm) 对上清液进行分解和过滤。 利用快速蛋白质液相色谱 (fplc) 系统, 以 1 mlmmin 的流速, 以 5 mL hepes 的结合缓冲液 (20 mm hepes, ph 7.5, 500 mm nacl, 10 mm 咪唑) 的流速平衡 5 ml imac 柱。 以 0.5 ml/min 的流速将过滤后的上清液加载到列上。 用5毫升的洗涤缓冲液 (20 mm hepes, ph 7.5, 500 mm nacl, 50 mm 咪唑) 在 1 mlmin 的流速下清洗色谱。 用 3 mm hepes (20 mm hepes, ph 7.5, 500 mm nacl, 350 mm 咪唑) 以 0.5 mlmin 收集的流速清除蛋白质。如果可用, 请选择上流洗脱模式, 以增加洗脱蛋白的浓度。 通过 sds-page 识别 fplc 色谱中含有感兴趣的蛋白质的组分, 并使用标准方法测量蛋白质浓度5。 使用离心超滤装置 (mwco 3 kda, 5 ml) 将含有最高蛋白质量的洗脱组分灌入2毫升。以 21, 000 x 克的离心机去除任何沉淀物, 并通过0.22 微米的过滤器。 用 fplc 在 1 mlmmin 的流速下, 用2毫升 s hepes (20 mm m hipes, 150 mm nacl, ph 7.5, 0.5 mm tcep) 平衡 120 ml 大小排除色谱 (s) 柱。 以 0.5 mL/min 的流速将2.1.9 浓缩的蛋白质注入色, 并以 1 cv s 缓冲液的速度流出, 收集 1 ml 组分。 像以前一样识别含有感兴趣的蛋白质的分数。 池含有最高数量蛋白质的分数。 存放在4°c 短期使用或添加甘油到20% 和储存在-80°c 在小的脂肪。 去除希斯6标签的 e-prd 蛋白的纯化 按照 2.1.1-2.1.8 中的步骤来纯化带有六标记的 e-prd 蛋白。集中峰值分数并确定蛋白质浓度。 在2μlmg 的集合蛋白中加入烟草蚀刻病毒 (tev) 蛋白酶 (1 mg/ml)。在4°c 下, 在 s 缓冲液中隔夜转移到透析管 (6 kda) 和透析液中。此步骤允许分离 his6 标签和去除咪唑, 这将干扰结合与 ni-nta 树脂在下一步。 在 s 缓冲液 3 cv 的重力柱中平衡5毫升的镍-nta 树脂。从树脂中排出多余的缓冲液。 将切割的 e-prd 蛋白倒在树脂上, 在摇杆平台上孵育 1小时, 使未分离的 his6 标记的 e-prd 和被切割的 his6 标记结合。tev 蛋白酶也是 his6 标记, 并将其结合树脂。收集流经, 其中包含无标签的 e-prd。用 2 cv s 缓冲液清洗树脂, 确保所有 e-prd 全部回收。 使用离心超滤装置 (mwco 3 kda, 5 ml) 将 e-prd 浓缩到2毫升。以 21 000 x g 的离心机去除任何沉淀物, 并通过0.22 微米的过滤器。 平衡一个 120 ml s 柱与 2 cv s 缓冲液 (20 mm hepes, 150 mL 氯化碳, ph 7.5, 0.5 mm tcep 为 mL 或 20 mm Tris-HCl, 1 mm dtt, ph 为 nmr), 流量为 1 mlmin, 使用 fplc。 将2.2.5 浓缩的 e-prd 蛋白注入 1 cv s 缓冲液的柱状和流出物, 流量为 0.5 mL/min, 收集 1 ml 组分。 像以前一样识别含有感兴趣的蛋白质的分数。 池含有最高数量蛋白质的分数。 存放在4°c 短期使用或添加甘油到20% 和储存在-80°c 在小的脂肪。 3. 核磁共振方法 核磁共振样品制备 纯化15n 标记的野生型或 r1914e e-prd 蛋白, 如前面所述, 使用 20 mm tris-hcl, 1 mm dtt, ph 值7作为步骤2.2.6 的 s 缓冲液。蛋白质库存溶液通常从0.3 到 1 mm 不等, 体积约为1毫升。注: 蛋白质可以浓缩到 & gt;100 μm 使用 mwco 3 kda, 5 ml 离心超滤装置, 使浓度进入适当的样品制备范围。 使用 20 mm Tris-HCl, 1 mm dtt, ph 7 作为步骤2.1.10 的 s 缓冲液, 纯化未标记的 vimrod 蛋白样本。 在500μl 的最终体积中, 将野生型或突变体 e-prd 蛋白添加到最终浓度为 100μm, d2o 为最终浓度为10% (v/v), dss (4, 4-二甲基-4-硅基戊酸-1-磺酸) 最终浓度为20μm。样品体积可达 500μl, 使用 20 mm tris-hcl, 1 mm dtt, ph 值7。表 4描述了具有代表性的样品制备。注: dss 的 0 ppm 共振用于校准1h 化学变化以及间接引用蛋白质的 15个n 化学转移。d2o用于氦锁定信号, 以保持光谱仪在一个恒定的净磁场下工作。 与上一步一样, 制备电子珠三角、d2o和 dss 的第二个样品, 并将 vimrod 添加到50μm 的最终浓度, 然后使体积达到500μl。 将500μl 样品转移到5毫米宽的核磁共振管进行实验。 核磁共振实验设置 使用弹出命令 “eject” 打开气流;这将使样品从磁铁。现在, 将样品放在磁铁顶部的旋转器中, 然后插入命令 “ij”。等待样品在磁铁内沉淀后再继续。 使用 “edc” 命令创建新数据集, 并通过选择实验 “zgpr” 加载标准1h nmr 参数 (图 1)。填写名称、expno (实验编号) 和 promno (处理过的数据文件夹号) 字段。在 “设置溶剂” 字段中选择溶剂, 然后单击 “执行” getprosol “, 阅读标准的人头和溶剂相关 (prosol) 参数。 将样品锁定到未化溶剂,即d2o, 使用命令 “锁定”, 并等待, 直到它完成扫描, 并实现锁定。 通过使用自动调谐命令 “atma” 调谐样品来校正磁体的共振频率。监视摆动曲线, 直到自动调整完成。 使用 topshim (命令 “topshim”) 来填充磁场。shimming 是调整磁场的过程, 以实现样品周围的均匀性。如果使用相同或相似的示例, 最好使用命令 “wsh” 存储填充物值, 并在 topshim 之前使用 “rsh” 读取它们。 使用 “rga” 命令调整接收机增益, 以实现最大信噪比。 将光谱的中心放在水共振偏移 (o1) 上, 并使用 “califbo1p1” 将90度质子脉冲 (p1) 设置在高功率。 使用零去 “zg” 命令收集质子谱, 并使用 “efp” 进行处理, 其中包括指数乘法 (“em”)、自由感应衰变 (fid), 包括线宽、fid “英尺” 傅立叶变换和 “pk” 应用相位校正。 使用不集成选项的多项式应用自动相位校正 “apk” 和自动基线校正 “abs”。 通过在实验中选择 “sfhmqc3gpph”, 为 sofast hmbc 实验创建一个新的数据集 (如 3.2.2)。 从质子频谱复制优化的 p1 和 o1, 并使用命令 “getprosol 1h p1 plw1” 填充 p1 依赖脉冲, 其中 p1 是优化的 p1 值, plw1 是 p1 的功率级别。 优化 cnst54 常数, 设置酰胺化学移位的偏移量, 并设置 cnst55 来定义带宽, 以包括感兴趣的光谱区域, 从而优化接收机增益 (图 2)。要选择这些参数, 请从二维光谱中提取第一个 fid (自由感应衰减), 并查找观察到的信号来定义它们。此外, 改变放松延迟 (d1)、扫描次数 (ns) 和虚拟扫描 (ds), 通过命令 “gs” 获得可接受的信号灵敏度, 从而使去和扫描能够实时监控数据质量。 使用 “零转” “记录光谱。 核磁共振数据处理 使用 “si f2ect2048, f1德·ecis 512”, 并在间接维度中进行可选的线性预测, 将处理参数设置为光谱的直接 f2 (1h) 和间接 f1 (15 n) 维数的大小 (图 3). 选择 “qsine” 作为窗口函数, 输入2的形铃移位 (ssb) 来处理二维谱。 输入命令 “xfb”, 使用窗口函数和傅立叶变换处理两个方向的数据。 使用命令 “apk2d” 在两个方向执行自动相位校正。如果自动过程不能达到令人满意的相位校正水平, 请使用 “rser” 命令提取 fid, 计算一维处理的相位值, 并将其应用于2d 数据。 使用2d 数据的自动基线校正功能 “abs 2” 更正基线。这将在处理参数中定义的 ppm 值之间应用多项式函数, 并将生成用于进一步分析的2d 频谱。 如果计划执行串行处理以比较与另一个分子的相互作用数据, 则将处理参数存储为命令 “wpar”, 并使用 “rpar” 调用它们。通过这种方式, 将使用相同的参数处理所有数据集, 并且由于处理差异而不会引入变体。 核磁共振数据分析 输入命令 “pp” 以开始峰值领料的过程。 根据预期峰值定义 ppm 范围和最小强度/最大峰值数 (图 4)。单击 “确定” 并通过目视检查验证结果。如果需要, 重新运行该过程, 直到根据光谱质量使结果令人满意。 使用 “pp” 命令生成峰值列表。注: 默认情况下, 此峰值列表包含数据高度峰值强度信息, 可以导出到后续频谱, 并可由其他程序读取。 观察蛋白质 hsqc 光谱中的峰值强度或化学变化的变化, 这些变化表明与另一个分子的相互作用。如果相互作用的分子很大, 则随着某些峰值的消失, 峰值强度会降低。 通过单击 “峰值” 选项卡并在峰值窗口中右键单击选择 “导入”, 将峰值列表导入到下一个数据集。 可视化频谱上的峰值, 并在需要时将其转移到新的位置。单击 “完整表” 的 “重置强度”, 生成具有强度的频谱的峰值列表 (图 5)。此峰值列表将从存储的峰值列表中传递位置信息。 通过选择 “导出” 函数, 将峰值列表从不同的数据集导出到电子表格或其他数学程序以进行分析。 计算每个峰值的峰值强度变化, 函数为 “复杂光谱中的峰值强度/蛋白质谱中的峰值强度”。值可以通过乘以100转换为百分比变化。请注意, 峰值体积也是有用的, 尽管峰值强度更容易测量彼此接近的峰值, 通常就像密度相对较宽的峰值的蛋白质一样。 4. 微尺度热像 (mst) 配体蛋白 e-prd 的制备 将配体转化为与 mM 兼容的缓冲液, 在 3.5 kda 微型透析单元中透析高达800μl 的蛋白质, 悬浮在 20 mm hepes 的1升中, ph 值 7.5, 10m ncl, 在4°c 隔夜缓慢搅拌。 使用离心超滤装置 (3 kda mwco) 将配体浓缩, 在 14 000 x 克的离心下进行 10分钟, 将浓缩的蛋白质转移到干净的管中。 以 21, 000 x 克离心配体 10分钟, 并小心地将上清液转移到新管中, 以去除任何沉淀的蛋白质。使用280纳米的吸收率和配体消光系数来确定配体的浓度。加入10% 的 tween-20, 使最终浓度为0.015。将 tween-20 添加到检测缓冲液中, 以防止吸附到毛细血管中。mM 实验的最终检测缓冲液为 20 mm hepes, ph 值 7.5, 10 mm 氯化钠, 0.015 Tween-20.。 染料标记靶蛋白维姆罗德的制备 通过加入与 red-tris-nta 一起提供的 1x pbs-t 50μl 来重新制备 red-tris-nta 染料, 使其浓度达到5μm。将2μl 等位分配到200μl 管中, 并存储在-20°c。 用检测缓冲液将目标蛋白稀释至0.34μm。将58μl 的目标加入降排-tris-nta 染料的 2μl aliquot 中, 在室温下孵育30分钟。染料标记靶点的最终浓度为0.33μm。以 21, 000 x 克的速度离心标记的目标 10分钟, 并小心地将上清液转移到新的管中, 以去除任何沉淀物。red-tris-nta 染料通过 his6 标记与蛋白质结合, 并在亚纳米摩尔范围内具有结合解离常数 (kd)。它实际上是100% 绑定到目标蛋白质, 所以不需要进一步的纯化。 打开 mst 仪器并打开控制软件。选择降排-tris-nta 染料的红色设置。将温度控制打开到25°c。 选择 “最漂亮” 以验证目标的标记, 并检查是否对试剂盒进行聚合或吸附。自动提供对这些参数的评估。 混合17μl 的检测缓冲液和3μl 的目标蛋白, 然后通过移液混合。通过将两个标准毛细血管浸入稀释后的目标中, 并将液体拉入毛细血管中心, 填充它们。将毛细血管放入托盘和仪器中。开始测量。 回顾结果, 寻找足够的荧光水平和没有吸附的迹象 (扭曲在毛细管线形状) 或聚集 (扭曲在 mst 痕迹), 将在软件分析中标记。如果结果是积极的移动到配体步骤, 如果不是一个不同的缓冲液必须尝试或 tween-20 的量可能增加到0.05% 或更高。 e-prd 配体双倍稀释系列的研制 通过标记1-16 的 16, 200μl 管, 准备稀释系列。 在1.17x 的浓度下加入17μl 的配体, 比 tube1 所需的最大配体浓度大。这个体积是所需量 (8.5μl) 的两倍, 然后将转移到下一个管串联。该检测的最终体积为 10μl, 因此1.17x 配体浓度的8.5μl 将通过添加1.5μl 的目标蛋白 vimrod 稀释为1x。所选择的最大浓度应至少为估计kd 值的20倍。 使用新的移液器尖端为每个外度添加8.5μl 的检测缓冲液。重复使用移液器吸头可能会影响精度 (有关准确移液的建议, 请参阅制造商的说明)。将8.5μl 配体从 tube1 转移到 Tube1, 慢慢地将溶液释放到检测缓冲液中, 而不会产生气泡。通过向上和向下移液至少 6次, 将配体和缓冲液混合, 同时不产生气泡。最集中管中的 e-prd 为 1.5 mm, 标记的 vimrod 最终浓度为 50 nm。 将8.5μl 配体从 tube2 转移到 Tube2, 并与检测缓冲液混合。重复连续稀释, 直到所有的管都加入了配体。从管贝16中丢弃 8.5μl, 使所有管在一系列双倍稀释中含有8.5μl 的配体。 结合反应和 mst 实验的制备 在每个试管中加入1.5 微米的标记目标蛋白, 然后通过上下移液轻轻混合, 小心避免气泡。孵化15分钟。 选择绑定分析的专家模式, 并输入串行稀释系列的参数。确保温度控制设置为 25°c, 励磁功率设置为 40%, mst 功率设置为介质。必须针对正在研究的其他绑定伙伴优化这些参数。 用结合反应填充毛细血管, 并将其放置在毛细管托盘中。将纸盒装入仪器, 等待温度恢复25°c 并开始测量。 数据分析 在亲和力分析软件中打开绑定分析文件。回顾毛细血管扫描;荧光水平与平均值的差异不应超过 10%, 不应检测到第3.6 节所述的聚集或吸附。 选择右侧面板上的 mst 分析, 并将分析数据拖到分析集中。如果在相同条件下有多个相同的目标配体结合试验, 它们可以通过掉落在同一集合中进行合并。或者, 可以独立地将每个运行放入分析中。 移动到 “剂量响应拟合” 选项卡以绘制数据图。如果需要单个绑定站点, 请选择 kd模型。hill 模型也是具有协作行为的多个绑定站点的一个选项。在此阶段, 可以从配合中删除未通过质量控制的异常点。合并集与多个检测将被平均和错误计算为标准偏差。 打开最终选项卡, 并比较单个图形上所有图形之间的结果。从生成的表中检索每个曲线的拟合结果。如果需要, 将数据或已安装的曲线导出到其他演示或分析软件。