口服抗生素治疗小鼠肠道微生物群的定量聚合酶链反应分析

本试验使用在特定的无病原体 (spf) 设施中维持的6-8 的野生型 (c57bl6 j) 小鼠进行。所有动物实验都得到了伦敦国王学院、弗朗西斯·克里克研究所动物福利和伦理审查机构以及联合王国内政部的批准。在开始任何动物程序之前, 确保通过当地机构/组织获得适当的许可。 1. 抗生素的管理 注: 提供了两种抗生素治疗的替代方法: 口服灌胃 (步骤 1.1) 和通过饮用水给药抗生素 (步骤 1.2)。 口腔灌胃 在高压灭菌水中溶解单个抗生素, 以下列浓度制备: 100 mg/ml 时的氨基青霉素、100 mg/ml 的 gentamicin、100 mg/ml 的新霉素、100 mg/ml 的 metronidazo 和 100 mgml 的 vancomycin。使用0.45μm 滤清器进行灭菌。在-20°c 下储存。 通过混合上面准备的库存来准备抗生素的鸡尾酒。对于1毫升的体积混合50μl 的氨基青霉素 (5 mg/ml 最终), 50μl 的庆大霉素 (5 mg/ml 最终), neomycin 50μl (最终为 5mg/ml), 甲硝唑 500μl (最终为 5mg/ml), vancocycin 为 25μl (最终为 2.5 mgmml), 水为325μl。使用前准备新鲜的鸡尾酒。 将抗生素混合装入无菌的1毫升注射器中, 并固定适当的量具灌胃针 (15-20 克小鼠 20 g), 同时消除任何气泡。 配有200μl 抗生素混合的 gavage 小鼠。 牢牢抓住老鼠肩膀上的皮肤, 伸展头部和颈部, 拉直食道。沿嘴顶和咽部后部方向引导进料针的球尖。然后, 轻轻地将其传递到食道中, 并注入200μl 溶液。 在实验期间, 每天服用一次抗生素鸡尾酒。 饮用水中的抗生素注意: 在饮用水中使用抗生素的前两周, 每天仔细监测小鼠体重。 在1升的蒸压水中溶解以下药物, 准备一种抗生素混合物: 1 克氨基青霉素 (1 gl 最终), 1 克 neomycin (1 gl 最终), 1 克甲硝唑 (1 gl 最终), 0.5 克 vancomycin (0.5 gl 最终) 和8袋 (每个0.75 克) 人造甜味剂 (60 克/最终)。摇一摇, 直到溶解。存放在4°c。注: 添加甜味剂, 以隐藏抗生素的味道, 并防止小鼠脱水。虽然几个甜味剂品牌可能有效, 但每个特定品牌所需的最终浓度可能不同。 将抗生素鸡尾酒放入水瓶 (~ 100 ml/瓶) 中, 然后将瓶子放在鼠笼上。注: 使用棕色瓶子或用铝箔覆盖瓶子, 以保护抗生素免受光线的影响。 在实验期间, 每周两次用新鲜的原料取代抗生素鸡尾酒。 2. 从粪便、含油量和岩壁收集粪便样品 重量和标签2毫升高压灭菌管的样品收集。 为了收集新鲜的粪便样本, 将每只老鼠放入约束器中, 并直接从肛门中收集粪便颗粒。注: 也可以通过将老鼠放在干净的蒸压笼中, 用干净的灭菌钳收集大便样本来获得样品。 用 co2 窒息对小鼠进行安乐死, 然后进行宫颈脱位。 将鼠标尸体放置在腹部完全暴露的情况下, 用70% 乙醇喷洒腹部。 使用消毒钳和剪刀, 在腹部做一个横向切口, 以暴露腹膜, 而不会损坏任何内部组织。提起腹膜, 做一个切口, 露出肠子。 用钳子和剪刀取出肠子 (从结肠到胃), 并将其放入无菌的 petri 培养皿中。 小心使用钳子将小肠 (si) 从肠系膜动脉和脂肪中移开。伸展肠道, 并把它放在一个干净的实验室擦拭。 用尺子测量和切割 si (最接近塞子的部分) 的远端回肠4厘米。切割和丢弃盲肠近端的1厘米的肠子。将有一个3厘米的部分回肠将用于收集肠道细菌。 将回肠部分 (3 厘米) 固定在2毫升的无菌管上。通过直接挤压肠道并将样品收集到试管中, 收集肠道内容。这个样本将含有来自回肠含量的细菌。 准备一个20毫升的注射器与冷磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和冲洗回肠部分 (丢弃流动)。 将回肠部分放在干净的纸巾上, 用剪刀纵向打开。 用手术刀刮伤回肠墙的内部。 收集手术刀上的任何细菌, 用1毫升的 pbs 在干净的离心管上清洗手术刀。以 8, 000xg旋转5分钟, 将细菌颗粒状, 并丢弃上清液。这个样本将含有回肠壁的细菌。注: 粪便、回肠含量和壁面的粪便样品可冷冻并储存在-80°c, 直至使用。 称量含有粪便和回肠含量样品的管, 并从空管中减去重量 (从步骤 2.1) 中减去, 以获得每个样本中的粪便重量。 使用市售试剂盒从粪便、回肠含量和回肠壁样品中提取细菌 dna。将 dna 样本存放在-20°c, 直至使用。 3. qpcr 对肠道微生物区系进行定量 注: 此过程包括生成标准 (步骤 3.1) 和标准和粪便样本的 qpcr 设置方法 (步骤 3.2) qpcr 标准的生成 利用聚合酶链反应 (pcr), 利用表1中详述的试剂13和 pcr 条件, 从细菌培养中提取的基因组 dna 中扩增 16s rrna 基因。 在1.5% 琼脂糖凝胶上运行 pcr 产品, 并使用市售 dna 提取试剂盒纯化 dna 带。 使用克隆试剂盒将纯化后的 dna 片段结扎 (见《材料表》, 使用含有抗生素耐药标记的载体和β-半乳糖苷酶 (lacz) 基因融合进行蓝/白色菌落选择), 并将 dh10 转化为合格的 dh10按照制造商的说明进行大肠杆菌。板材转化为氨基青霉素 (100μg/ml), x-gal (20μg/ml) luria bertani (lb) 琼脂板 (10 gml 色拉坦, 5 gl 酵母提取物, 10 gml ncl, 15 gl 琼脂)。在37°c 下隔夜孵化 (on)。 从板材中选择一个正 (白色) 菌落。在含有100μgml 氨基青霉素的5毫升 lb 肉汤中接种, 在37°c 下孵育 obe, 在250转/分的情况下晃动。 从 on 培养中, 根据制造商的说明, 使用商用微型制备试剂盒分离和纯化质粒。注: 重要的是要在这个阶段对质粒插入进行排序, 以确保质粒只包含 16s rrna 基因的一个副本, 并以基对 (bp) 确定其长度。 用限制性酶对质粒进行线性化, 该酶只将质粒切掉一次。 使用市售试剂盒纯化线性化质粒。 利用分光光度计测量260纳米的吸收率, 测定质粒的浓度。 使用以下公式14计算样品质粒的数量:份数= (数量* 6.0 22×1023)/(长度* 1×109 * 650)其中数量是在步骤 3.1.8 (ngμl) 中获得的 dna 浓度;和长度是质粒的总长度 (与插入) 在 bp。副本的数量将以副本的方式获得。注: 有基于上述公式的在线工具, 可以轻松计算质粒副本的数量。 在-20°c 的温度下, 根据需要将标准储存至使用前。 标准样品和粪便样品的 qpcr 设置 在冰上解冻 qpcr 标准 (从步骤 3.1.10)、粪便样本 dna (从步骤 2.15) 和 qpcr 试剂 (从市售试剂盒)。注: 本例中使用的 qpcr 试剂包括 sybr 绿色 qpcr 反应混合物以及正向和反向引物 (表 2)。 在无菌无 dna 水中稀释标准, 范围为 107 至10 2 铜(例如,从 107 到 6.4 x 10 铜的连续稀释从 10 7 到 6.4 x10铜)。稀释粪便样本 dna 到半, 半, 半. 对反应总数加1进行主混合反应 (表 2)。 混合30μl 的主混合和5μl 的模板 (标准, 样品或水的负控制) 在384口井的光学 qpcr 板中, 将这种混合物的10μl 添加到每口井中。执行每个反应一式三份。 密封 qpcr 位置, 短暂地离心并将板材加载到 qpcr 机器上, 其循环条件如下: 95°c 20分钟, 然后40个周期 95°c 15秒, 60°c, 1分钟。 获取标准和示例的 ct值。 通过绘制标准的 ct 值与质粒复制数的对数 (在步骤3.1.9 中计算) 来生成标准曲线。执行标准曲线的线性回归。 通过在标准曲线中插值 ct值 (在步骤3.2.2 中获得), 计算粪便样本的 16s rdna 拷贝数。注: 应考虑到样品的稀释系数 (在步骤3.2.2 中制备)、被洗脱的最终体积核酸 (步骤2.15 中) 和粪便样本的数量 (在第2.15 步中计算), 应更正每个样品的 16s rdna 拷贝数, 以获得每克粪便的基因拷贝。