تحليلات تستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية الحجمية المعوية مورين بعد العلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم
Summary
هنا نقدم بروتوكولات مفصلة لإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم للفئران، وجمع عينات البراز، واستخراج الحمض النووي والتحديد الكمي للبكتيريا البراز من قبكر.
Abstract
الحجمية القناة الهضمية لها تأثير مركزي على صحة الإنسان. ديسبيوسيس الميكروبية يرتبط مع العديد من إيمونوباثولوجيس الشائعة مثل مرض التهاب الأمعاء والربو والتهاب المفاصل. وبالتالي، فهم الآليات التي يقوم عليها النظام المناعي الحجمية الحديث المتبادل من الأهمية بمكان. إدارة المضادات الحيوية، بينما تساعد إزالة مسببات المرض، يدفع أيضا تغييرات جذرية في حجم وتكوين المجتمعات البكتيرية المعوية التي يمكن أن يكون لها تأثير على صحة الإنسان. العلاج بالمضادات الحيوية في الفئران يجمل أثر والتغيرات الطويلة الأجل في الحجمية البشرية من المرضى المعالجة المضادات الحيوية، ويمكن التحقيق في الروابط آليا بين التغيرات في المجتمعات الميكروبية ووظيفة الخلايا المناعية. في حين قد وصفت عدة أساليب للعلاج بالمضادات الحيوية من الفئران، بعضهم حمل الجفاف الحاد وفقدان الوزن تعقيد تفسير البيانات. هنا، نحن نقدم اثنين من البروتوكولات للفم المضادات الحيوية التي يمكن أن تستخدم لعلاج طويل الأجل للفئران دون حمل الوزن الرئيسية. هذه البروتوكولات تجعل استخدام مزيج من المضادات الحيوية التي تستهدف كل إيجابية وسلبية الغرام البكتيريا ويمكن أن تقدم أما libitum الإعلانية في مياه الشرب أو بواسطة تزقيمية الشفوي. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للكثافة الميكروبية في عينات البراز من قبكر التي يمكن استخدامها للتحقق من فعالية العلاج المضادات الحيوية. ويوفر الجمع بين هذين النهجين منهجية يمكن الاعتماد عليها للتلاعب الحجمية المعوية، ودراسة آثار العلاج بالمضادات الحيوية في الفئران.
Introduction
الغشاء المخاطي المعدي المعوي الثدييات هي بيئة فريدة من نوعها من استعمر خليط معقدة للغاية من الكائنات المجهرية التي تنشئ علاقة المنفعة المتبادلة مع البلد المضيف. يشمل نظام الدفاع مخاطية الأمعاء طبقة الظهارة وعدد كبير من الخلايا المناعية التي تقيد commensals داخل الأمعاء بينما الحفاظ على العدد والتنوع. على العكس من ذلك، commensal الكائنات المطلوبة لتطوير نظام المناعة تعمل بكامل طاقتها. بينما التفاعلات بين المضيف والبكتيريا كومينسال عادة مفيدة، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الحديث المتبادل المناعي-الحجمية dysregulated يمكن لصالح تطوير الأمراض المزمنة التحريضية، مثل الأمعاء أسينفلاماتوري المرض أو التهاب المفاصل أو الربو1،2.
ويمكن تغيير الحجمية القناة الهضمية بعوامل مختلفة، ولكن ربما هي أهم التغييرات الناجمة عن العلاج بالمضادات الحيوية أن يغير شدة كل من حجم وتكوين المجتمعات البكتيرية3،4. في حين لا مراء فيها فوائد المضادات الحيوية لعلاج العدوى، يمكنك أيضا تعديل التغييرات الحجمية الناجمة عن التعرض للمضادات الحيوية في البشر الدفاعات المناعية التي يمكن أن تؤدي إلى آثار ضارة بالصحة. على سبيل المثال، ارتبط العلاج بالمضادات الحيوية في البشر إلى زيادة خطر المطثيّةالعسيرة-الناجمة عن الإسهال والربو وأنواع معينة من السرطان3. العلاج بالمضادات الحيوية في الفئران ويجمل بالأثر وتغييرات طويلة الأجل وجدت في المجتمعات المحلية الغريزي للمرضى المعالجة بالمضادات الحيوية، وقد مكن التحقيق في الروابط آليا بين التغيرات في المجتمعات الميكروبية ووظيفة الخلايا المناعية. ومع ذلك، أظهرت عدة تقارير أن الإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب إعلانية libitum النتائج في فقدان الوزن ملحوظ جداً كما الفئران الامتناع عن مياه الشرب، ويفترض أنه سبب لها طعم كريهة5،6. وهكذا، في هذه النماذج الجفاف الشديدة المصاحبة لإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم قد يؤدي إلى تعقيد تفسير تجارب تهدف إلى التعرف على تأثير العلاج بالمضادات الحيوية في وظيفة الخلايا المناعية.
يمكن استخدام العديد من الطرق لاستكشاف حجم وتكوين المجتمعات الميكروبية في الأمعاء المقصورة7. الجيل القادم يسلسل تقنيات قدمت بيانات لا تقدر بثمن في هذه المسألة8، بيد أن هذه الأساليب ليست باهظة الثمن نسبيا وتتطلب تحليلات الخبراء بيوينفورماتيك لتفسير البيانات. من ناحية أخرى، تسمح الثقافة التقليدية الميكروبيولوجية أساليب الكشف عن الأنواع البكتيرية، ولكن لديهم حساسية منخفضة وجزء كبير من البكتيريا كومينسال (لا سيما اللاهوائيات) من الصعب جداً أو من المستحيل زراعتها مع الأساليب المتاحة حاليا8. الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (qPCR) تقنيات تستخدم متزايد للقياس الكمي، وتحديد أنواع الجراثيم البرازية، كما أنها توفر تدبيرا مستقلاً عن ثقافة سريعة وموثوق بها من مجموع الحمولة الميكروبية. وبناء على ذلك، أثبتت qPCR أساليب مفيدة لدراسة التغيرات في الحجمية المرتبطة مع التقدم في العمر، أو مع تطور العديد من الأمراض بما فيها التهاب الأمعاء المرض9،10. وتمشيا مع هذا، توفير أساليب qPCR نهج سريعة وفعالة من حيث التكلفة للتحقق من تأثير العلاجات المختلفة (بما في ذلك المضادات الحيوية) في البراز البكتيرية الأحمال والحجمية تكوين10،،من1112.
هنا، نحن نقدم مفصل خطوة بخطوة للبروتوكولين متميزة لإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم للفئران، وجمع عينات البراز، واستخراج الحمض النووي، وإعداد المعايير والقياس الكمي للبكتريا في عينات البراز قبل قبكر. توفر هذه البروتوكولات طريقة موثوقة للتلاعب الحجمية المعوية في الفئران ودراسة آثار العلاج بالمضادات الحيوية في التوازن المعوية، والمرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم البروتوكولات التجريبية للإدارة عن طريق الفم من المضادات الحيوية للفئران والتحديد الكمي للبكتيريا البراز من قبكر. المزيج من المضادات الحيوية المستخدمة في هذه الأهداف البروتوكول (التي تحتوي على النيوميسين، مترونيدازول الأمبيسلّين والجنتاميسين فانكومايسين) البكتيريا سواء كانت إيجابية أو سلبية الغرام، تقدم نشاط جراثيم ضد طائفة كاملة من البكتيريا. تزقيمية الشفوي والإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب إلى حد كبير تقليل البكتيريا البراز تحميل5،،من612. وعلاوة على ذلك، كل العلاجات تأثيراً عميقا على النمط الظاهري للفئران كما أنها تضع العديد من الخصائص النموذجية من الفئران جرثومة مجاناً بما في ذلك حجم الطحال المخفضة والاعور الموسع. ربما قد يتوقف اختيار أسلوب معين الصادات على طول التجربة كما يتطلب الأسلوب تزقيمية الشفوي الإدارة اليومية للمضادات الحيوية، كونها كثيفة العمالة أكثر وربما يسبب المزيد من عدم الراحة الحيوانات في الأجل الطويل.
للإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب، يجب توخي الحذر مع إضافة التحلية إلى خليط المضادات الحيوية وهذا عامل حاسم للحفاظ على الفئران من الجفاف. وقد أظهرت عدة مجموعات كيف الإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب (بدون إضافة مادة التحلية) يؤدي إلى فقدان الوزن الشديد والسريع جداً مع جميع الفئران فقدان أكثر من 20% وزن الجسم الأولية خلال الأيام القليلة الأولى من تجربة5 , 6-لدينا بروتوكول، استخدام التحلية المستندة إلى سكري كافية لإخفاء طعم المضادات الحيوية في الماء وفقدان الوزن في الأيام القليلة الأولى بعد الصادات الفئران على ما يبدو، ولكن استعادت أوزانها بسرعة بعد ذلك ( الشكل 1). ومع ذلك، في تجاربنا 5-10% فئران لا تزال تصل إلى نقطة النهاية البشرية من > فقدان 20 ٪ من خط الأساس وزن جسم ويلزم أن يكون euthanized. لدينا أيضا اختبار المحليات على أساس sucralose التي فشلت تماما لمنع التجفاف الفئران (100% فئران فقدت > 20% وزن) بينما مؤلفين آخرين قد نشرت إخفاقات مماثلة للمحليات على أساس aspartame5،6. ويضاف إلى ذلك، السن والخلفية الوراثية والحالة الصحية العامة للفئران المستخدمة للتجارب ينبغي النظر، كما أنها قد تؤثر على الوزن ورفاه الحيوان أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. وبالتالي، ينبغي إجراء رصد دقيق لوزن الفئران والحالة الصحية العامة يوميا خلال الأسبوعين الأولين من إدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم.
توفير أساليب qPCR نهج سريعة وفعالة من حيث التكلفة للتحديد الكمي الرنا الريباسي 16S في عينات البراز. ومع ذلك، ينبغي النظر في بعض القيود فيما يتعلق بهذه التقنية بما في ذلك: أنا) الحاجة إلى معيار عالية الجودة يمكن الاعتماد عليها؛ ثانيا) على التصميم وكفاءة الإشعال قبكر؛ ثالثا) حقيقة أن الكائنات الحية الدقيقة قد يكون إعداد نسخ مختلفة من الجينات الرنا الريباسي 16S، ومن ثم نسخ الجينات قد لا مباشرة تساوي الخلية التهم15. ومع ذلك، قبكر هو أسلوب قوي والحساسة التي تتيح التحليل السريع لعينات البراز. يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيداً بشكل خاص بسرعة التحقق من تأثير العلاجات المختلفة (بما في ذلك المضادات الحيوية) في البراز البكتيرية الأحمال هنا مفصلة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن نقدم على بروتوكول للتحديد الكمي مجموع 16S الرنا الريباسي، هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف بسهولة (عن طريق تصميم كبسولة تفجير محددة16) تمكين تحديد الأصناف البكتيرية الفردية، وبالتالي توفير كل الكمية و الحصول على معلومات نوعية عن حجم ميكروبيومي وتكوينها.
وباختصار، لقد قدمنا البروتوكولين للعلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم من الفئران وطريقة qPCR لقياس التغيرات المستحثة بالمضادات الحيوية في البكتيريا البراز. على الرغم من أن هذه البروتوكولات يمكن كذلك الأمثل وجنبا إلى جنب مع النهج الأخرى وفقا للاحتياجات الفردية التجريبية، أنها قد تخدم كأدوات سريعة وفعالة من حيث التكلفة وموثوق بها للتلاعب الحجمية المعوية موريني ودراسة الآثار للعلاج بالمضادات الحيوية في التوازن المعوية، والمرض.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل “مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة” (منحة للجريدة السيد/L008157/1)؛ الملكية الأردنية وأيده “زمالة ماري كوري الأوروبي” (H2020-مسكاً-لو-2015-703639)؛ P.M.B. وكان يدعمها منحة من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة وكلية لندن الدكتوراه التدريب الشراكة الملك في “علوم الطب الحيوي” (MR/N013700/1).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
| Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
| Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
| Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
| NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
| X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
| Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
| RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
| TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
| QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
| QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Syringe filter 0.45µm | Fisher scientific | 10460031 | |
| Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Syringe (20 ml) | BD Plastipak | 300613 | |
| 1.5ml Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
| 2ml Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
| Oral dosing needles 20Gx38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
| Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
| Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
| MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
| ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
| Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
| MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |
References
- Belkaid, Y., Hand, T. W. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 157 (1), 121-141 (2014).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Ubeda, C., Pamer, E. G. Antibiotics, microbiota, and immune defense. Trends in Immunology. 33 (9), 459-466 (2012).
- Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing. PLoS Biology. 6 (11), e280 (2008).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), e17996 (2011).
- Hill, D. A., et al. Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis. Mucosal Immunology. 3 (2), 148-158 (2010).
- Fraher, M. H., O’Toole, P. W., Quigley, E. M. Techniques used to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (6), 312-322 (2012).
- Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
- Sokol, H., et al. Low counts of Fecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota. Inflammatiry Bowel Diseases. 15 (8), 1183-1189 (2009).
- Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, G. T., McMurdo, M. E. Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota. Applied Environmental Microbiology. 70 (6), 3575-3581 (2004).
- Ubeda, C., et al. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (12), 4332-4341 (2010).
- Saez de Guinoa, J., et al. CD1d-mediated lipid presentation by CD11c(+) cells regulates intestinal homeostasis. EMBO Journal. 37 (5), (2018).
- Kruglov, A. A., et al. Nonredundant function of soluble LTalpha3 produced by innate lymphoid cells in intestinal homeostasis. Science. 342 (6163), 1243-1246 (2013).
- Wilhelm, J., Pingoud, A., Hahn, M. Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes. Nucleic Acids Research. 31 (10), e56 (2003).
- Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Computational Biology. 8 (10), e1002743 (2012).
- Yang, Y. W., et al. Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces. Applied Environmental Microbiology. 81 (19), 6749-6756 (2015).
