経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

ここで説明した実験は、6-8 週間特定病原体無料 (SPF) 施設で維持される古い野生型 (C57BL6/J) マウスを使用して行った。すべての動物実験は、College ロンドン王のとフランシス Crick 研究所動物福祉と倫理的なレビュー体とイギリス内務省によって承認されました。任意の動物の手順を開始する前に、適切なアクセス許可がローカルの機関を通じて得られることを確認します。 1. 抗生剤の投与 注: 抗生物質治療の 2 つの代替方法があります: 経口 (ステップ 1.1)、飲料水 (ステップ 1.2) 経由で抗生剤の投与。 経口 次の濃度でオートクレーブ養生水にそれらを溶解することにより個々 の抗生物質の在庫を準備: アンピシリン 100 mg/mL で、100 mg/mL でゲンタマイシン、ネオマイシン 100 mg/mL で、10 mg/mL にメトロニダゾールと 100 mg/mL でバンコマイシン。フィルターは、0.45 μ m のフィルターを使用して滅菌します。因数と-20 ° C にてストア 抗生物質のカクテルを準備するには、上記準備株式を混合します。1 mL のボリュームのアンピシリン (5 mg/mL 最終) の 50 μ L、ゲンタマイシン (5 mg/mL 最終) の 50 μ L、ネオマイシン (5 mg/mL 最終) の 50 μ L、メトロニダゾール (5 mg/mL 最終) を 500 μ l 添加、バンコマイシン (2.5 mg/mL 最終) の 25 μ L、325 μ L の水を混ぜます。使用する前に新鮮なカクテルを準備します。 1 mL の滅菌注射器に抗生物質のミックスを読み込み、任意の気泡を除去しながら適切なゲージ強制経口投与針 (15-20 g のマウス用 20 G) を修正します。 強制経口投与マウス抗生物質ミックスを 200 μ l 添加します。 マウスの肩越しに皮膚をしっかりとつかむ、頭頸部、食道をまっすぐに伸ばします。口と咽頭の後方の屋根に沿って餌針の先端球を直接します。軽く食道に伝承し、200 μ L 溶液を注入します。 実験の期間中毎日抗生物質カクテル 1 回を管理します。 飲料水の抗生物質注意: 慎重にマウスの重量を毎日監視飲料水の抗菌薬投与の最初の 2 週間のため。 オートクレーブ水 1 リットルで次を溶解することにより抗生物質のカクテルを準備: アンピシリン (1 g/L 最終)、ネオマイシン (1 g/L 最終)、メトロニダゾール (1 g/L 最終)、バンコマイシン (0.5 g/L 最終) と人工の 8 袋 (0.75 g) の 0.5 グラムの 1 グラムの 1 グラムの 1 グラム甘味料 (60 g/L 最終)。溶解するまで横に振る。4 ° C でのストア注: 甘味料は、抗生物質の味を非表示し、マウスの脱水を防ぐために追加されます。甘味料のいくつかのブランドを動作可能性があります、必要な最終濃度各特定ブランドの異なるかもしれません。 水のボトルに抗生物質カクテルを埋める (~ 100 mL/ボトル) マウス ケージにボトルを置くと。注: は、茶色のボトルを使用または抗生物質を光から保護するために箔のボトルをカバーします。 実験の期間週 2 回新鮮な在庫で抗生物質カクテルを置き換えます。 2. 糞便スツール、回腸のコンテンツ、および回腸壁からの収集 重量を量るし、ラベルを 2 mL サンプル コレクションのオートクレーブのチューブ。 新鮮な糞便のコレクションの落に各マウスを配置し、コレクション チューブで肛門から直接糞を収集します。注: サンプルは、きれいなオートクレーブのケージにマウスを置き、クリーンな滅菌ピンセットで便のサンプルを収集も入手できます。 頚部転位続いて CO2窒息とマウスを安楽死させます。 完全にさらされる腹部とマウスの死骸を置く、70% エタノールで腹部をスプレーします。 滅菌ピンセットとはさみを使って、任意の内部の組織を傷つけることがなく、腹膜を公開する腹部横切開を作る。腹膜を持ち上げて、切開、腸を公開します。 鉗子、はさみ (胃大腸) から腸を取り出し、滅菌シャーレに置きます。 腸間膜動脈と脂肪から鉗子を使用して小腸 (SI) 慎重に。腸を拡張し、きれいな研究室ワイプの上に置きます。 定規で測定し、SI (盲腸に近い部分) の回腸遠位部の 4 cm カットします。カットし、盲腸に近位小腸の 1 cm を破棄します。回腸の腸内細菌を収集するために使用される左の 3 cm 部分があります。 2 mL の生殖不能の管に回腸部分 (3 cm) を保持します。腸および補綴チューブにサンプルを直接押し出して腸内容を収集します。このサンプルは、回腸内容から菌を持っています。 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 20 mL の注射器を準備し、回腸部分 (流れを破棄) をフラッシュします。 きれいなペーパー タオルの上に回腸部分を置き、縦はさみでそれを開きます。 メスと回腸壁の内側をこすり。 きれいな遠心管に 1 mL の PBS とメスを洗浄することによりメスの任意の細菌を収集します。8,000 × gペレット細菌、上澄みを廃棄し 5 分で回転します。このサンプルは、回腸の壁から細菌を含まれます。注: 糞便スツール、回腸内容、壁からすることができます凍結し、使用まで-80 ° C で保存します。 スツールと回腸のコンテンツからのサンプルを含んでいる管の重さし、各サンプルの糞便の重量を取得する (手順 2.1) から空のチューブから重さを引きます。 スツール、回腸内容、市販のキットを使用して回腸壁サンプルから DNA を抽出します。使用するまで-20 ° c の DNA のサンプルを格納します。 3. qPCR による腸内細菌叢の定量化 注: この手順を含む標準 (ステップ 3.1) の生成と qPCR セットアップ標準と糞便のサンプル (ステップ 3.2) のためのメソッド QPCR の標準の生成 試薬13および表 1に詳細な PCR の状態を使用して細菌文化から抽出したゲノム DNA からの 16S rRNA 遺伝子を増幅するポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用します。 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品を実行し、市販 DNA 抽出キットを使用して DNA バンドを浄化します。 精製 DNA のフラグメントを使用してクローニング キット (材料表、抗生物質耐性マーカーと青/白の植民地選択のための β-ガラクトシダーゼ (LacZ) 遺伝子融合を含むベクターを使用を参照してください) を縛る DH10 の有能なを変換して大腸菌製造元の指示に従います。アンピシリンに変換プレート (100 μ g/mL) X ギャル (20 μ g/mL) ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天 (10 g/L トリプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、寒天 15 g/L の 10 g/L を 5 g/L)。インキュベート 37 ° C で一晩 (O/N) プレートから 1 つの陽性 (ホワイト) コロニーを選択します。100 μ g/mL アンピシリンを含む 5 mL LB 培地に接種して 37 ° C, 250 rpm で揺れで O/N を孵化させなさい。 O/N 文化から隔離し、製造元の指示に従って商業 miniprep のキットを使用してプラスミッドの浄化します。注: この段階で、プラスミッドに 16S rRNA 遺伝子のコピーを 1 つだけが含まれていることを確保し、塩基対 (bp) にその長さを決定するプラスミッド挿入をシーケンスすることが重要です。 一度だけプラスミッドを切る制限の酵素が付いているプラスミッドをリニア化します。 市販のキットを使用して線形プラスミッドを浄化します。 260 で吸光度を測定することによってプラスミッドの濃度を決定する nm の吸光度。 プラスミッドのコピー/μ L14次の数式を使用して、サンプルの数を計算します。コピーの数= (量* 6.022 × 1023)/(長さ* 1 × 109 * 650)3.1.8 の手順 (ng/μ L); で得られた DNA 濃度の量が長さbp (挿入) が付いているプラスミッドの長さの合計です。コピー/μ L とコピーの数を取得します。注: 上記の数式に基づいてオンライン ツールでプラスミッドのコピーの数の簡単な計算を可能にするがあります。 因数とストア-20 ° C で使用されるまで必要に応じて標準。 qPCR 標準および糞便サンプルのセットアップ QPCR (ステップ 3.1.10) から標準、糞便検体 DNA (ステップ 2.15) と氷 (から市販キット) qPCR 試薬を解凍します。注: この例で使用する qPCR 試薬には SYBR グリーン qPCR 反応混合物および前方および逆のプライマー (表 2) が含まれます。 10 からの範囲で滅菌 DNA 無料水の標準を希釈7 102コピー/μ L (10 からシリアル希薄など1/57 102コピー/μ L x 6.4)。希釈糞便サンプルの DNA を 1/2、1/5、1/10. 反応プラス 1 (表 2) の総数のためのマスターの組合せの反応を確認します。 マスター ミックスとテンプレート (標準、サンプルまたは否定的な制御のための水) の 5 μ L のミックス 30 μ L 384 ウェル光 qPCR プレートの各ウェルに、このミックスの 10 μ L を追加します。3 通の各反応を実行します。 QPCR 場所をシール、簡潔に遠心し、次のサイクリング条件でプログラム qPCR マシンでプレートを読み込む: 95 ° C、20 分が 95 ° C の 40 のサイクルが続く 15 秒/1 分の 60 ° C。 CT標準とサンプルの値を取得します。 (3.1.9 のステップで計算される) としてプラスミッドのコピー数の対数対基準 CTの値をプロットすることによって標準的な曲線を生成します。標準曲線の直系の回帰を実行します。 CT値 (3.2.2 の手順で得られた) 標準的な曲線で補間することによって糞便の 16S rDNA のコピー数を計算します。注: 各サンプルの 16S rDNA のコピー番号が修正されるべき (3.2.2 の手順で準備)、サンプルの希釈倍率を考慮した (ステップ 2.15) に溶出した最終巻核酸および糞便サンプル (の計算ステップ 2.14) を取得する数糞便のグラムあたり遺伝子をコピーします。