الفصل بين "السبانخ ثايلاكويد البروتين المجمعات" بالتفريد هلام الأخضر الأصلي وتوصيف الفرقة استخدام "العد فوتون واحد تيميكوريلاتيد"

يجب ضبط التمثيل الضوئي في الكائنات الحية باستمرار علم وظائف الأعضاء إلى تغيير الظروف البيئية تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والتنافس بنجاح مع الجيران¹. وهذا ينطبق بشكل خاص للآلية المسؤولة عن ردود فعل الضوء لعملية التمثيل الضوئي، كالضوء العام الشروط يمكن أن تتقلب بثلاثة أوامر من حجم بين الظلال وأشعة الشمس الكاملة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تقلل من العوامل البيئية مثل الجفاف أو البرد أو الإجهاد الحراري توافر غاز ثاني أكسيد الكربون لتثبيت الكربون، وهو الحوض إلكترون الطبيعية للمنتجات من ردود فعل الضوء. النباتات يجب، ولذلك الحصاد واستخدام الإشعاع الشمسي أكبر قدر ممكن من الكفاءة مع الاحتفاظ بالقدرة على تبديد الطاقة الخفيفة الزائدة حسب الضرورة. وفي حين فوتوكسيداتيفي الضرر لا يزال يحدث بشكل روتيني تحت جميع ظروف الإضاءة^2،3، الفشل في إدارة الطاقة الإثارة استيعابها بنجاح يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا كارثية والموت. وتوجد عدة آليات التكيف التي تسمح لجهاز التمثيل الضوئي ضبطها للتغيرات في الظروف البيئية السائدة ولتقلبات عابرة (أي، على مدى فترات زمنية طويلة وقصيرة على حد سواء)⁴. وتشمل هذه استجابة طويلة الأجل (لاتينية) وتبريد غير الضوئية (نبق). نبق في حد ذاته يعتبر أن تشمل على الأقل ثلاثة ظواهر المكون الأخرى، بما في ذلك حالة الانتقال (كيو تي) والطاقة إيندوسيبلي سرعة التبريد (qE) فوتوينهيبيشن (تشي)⁵.

لاحظ هذه العمليات والمعرفة إلى حد كبير فيما يتعلق بالظواهر الطيفية أصلاً [مثل نبق يشير إلى انخفاض في الأسفار الكلوروفيل الملاحظة (تبريد للأسفار الكلوروفيل) ليس بسبب زيادة في المعدل الكيمياء الضوئية]⁶. وبالمثل يشير مصطلح “انتقالات الحالة” إلى التغيير الملحوظ في قدر نسبي من الأسفار من هذه المبادرة، وبسيي⁷. بينما التقنيات الطيفية التي مكنت من تعداد هذه الظواهر [على وجه الخصوص، السعة نبض التضمين الطيفي الفلورية (بام)] ويستمر أن يكون وسيلة حيوية لرصد وتحليل عمليات التمثيل الضوئي في فيفو، قدرا كبيرا من الكيمياء الحيوية مطلوب توضيح الآليات الكامنة وراء هذه الملاحظات الطيفية. على سبيل المثال، يتضمن انتقالات الدولة، دورة الفسفرة/ديفوسفوريليشن من البروتينات لهسيي كيناز STN7 والفوسفاتيز TAP38/PPH1، على التوالي^8،،من⁹¹⁰. يضبط هذا الدورة التوزيع المادي للهوائي لهسيي بين فوتوسيستيمس اثنين بنقل جزء من أرتب لهسيي من بسيي لهذه المبادرة، وبالتالي تغيير الامتصاص المقطع العرضي لل^11،فوتوسيستيمس¹². سرعة تحويل عنصر التيسير الكمي لنبق الطاقة الإثارة الزائدة في الحرارة من خلال إجراءات دورة إبوكسدة/دي-إبوكسدة فيولاكسانثين/تين وزياكسانثين والبروتين الهيئات الفرعية الرئيسية. الدور المحدد للهيئات الفرعية الرئيسية في هذه العملية لا يزال لا يفهم تماما¹³. عنصر تشي لنبق، فوتوينهيبيشن، يعزى عموما إلحاق الضرر بالبروتين D1 من بسيي. استعادة صلاحية كاملة التمثيل الضوئي يتطلب عملية إصلاح وضع لإصلاح تلف بسيي فوتوسينتيرس. دورة إصلاح بسيي ينطوي على هجرة مجمعات بسيي من مداخن جرانال، تفكيك المجمعات، واستبدال التالفة D1 البروتينات، إعادة تجميع مجمعات بسيي، والحركة من مجمعات بسيي العودة إلى الكدسات جرانال¹⁴. ويظل الطابع الدقيق فوتوينهيبيشن وبسيي د موضوع تدقيق مكثف¹⁵.

الصعوبة في دراسة ظواهر مثل الدولة والتحولات أو إصلاح بسيي ينبع جزئيا من حقيقة أن هناك لا أحد طريقة بسيطة لتصور آليات النظم البيوكيميائية المعقدة. أن النهج البيوكيميائية الكلاسيكية لفهم عملية أول فصل مكوناته حتى أنه يمكن أن توصف بأنها تعيش في عزلة. نشأت التفريد جل أصلي من الجهود الناجحة في الثمانينات إلى فصل وتميز مجمعات photosystem من الأغشية ثايلاكويد بأكثر الأساليب محضرة (هما السكروز التدرج الطرد المركزي والفصل اللوني)¹⁶. النظم المنظفات التي وضعت لجعل بلطف مجمعات السكان الأصليين من الأغشية ثايلاكويد كانت قريبا تتكيف طرق فصل الغرواني الكهربي، أبرزها ستاهلين والين¹⁷ وو ثورنبير وبيتر¹⁸، مما يثير للتفريد هلام الأخضر الأصلي. وفي حين تمثل واحدة فقط من مجموعة متنوعة من التقنيات في ترسانة التجريبية، الصفحة الأصلية لديها عدد من الخصائص الجذابة التي جعلت من أسلوب العاملين على نطاق واسع في بحوث عملية التمثيل الضوئي. الصفحة الأصلية نسبيا سريعة وبسيطة، تتطلب معدات متخصصة قليلاً، بينما توفر عالية الدقة فصل عدد كبير من مجمعات ثايلاكويد في وقت واحد. وهذا يجعل الصفحة الأصلية أداة ملائمة لدراسة ديناميات ثايلاكويد، وعندما يقترن صفحة قياسية في البعد الثاني، فضلا عن مجموعة متنوعة من نظم المنظفات والمخزن المؤقت، نظام متعدد الاستخدامات لإيجاد وتميز جديد ثايلاكويد المجمعات.

أن يقال، الجل الأخضر الأصلي كان سمعة لكونه أسلوباً غير موثوق بها، لا سيما في أيدي عديمي الخبرة، كما أنه من السهل لإنتاج النتائج السيئة التي تتكون من المواد الهلامية غامض، ملطخ مع العصابات القليلة. تم حل هذه المشكلة، في جزء منه، مع الأخذ بأصلي الأزرق-الصفحة¹⁹. استخدام صبغة كوماسي في النظام المخزن المؤقت BN يجعل فصل البروتين أكثر قوة. ولذلك، BN-الصفحة في كثير من الأحيان أسلوب أسهل وأكثر موثوقية للمبتدئين نسبية لإعداد ويمكن توفير نسخ فصل الألوان عالية الدقة لمجمعات ثايلاكويد. لهذه الأسباب، أصبحت BN-الصفحة الأسلوب المفضل لمعظم العمل في هذا الميدان. بينما BN-الصفحة أبطأ عموما لتشغيل من التفريد هلام الأخضر، العيب الرئيسي فيها أن تلطيخ صبغة كوماسي يتداخل مع تحديد العصابات التي تحتوي على الكلوروفيل باهتة، بينما أيضا مما يجعل المتلقين للمعلومات الطيفية توصيف إشكالية.

المعلومات البيوكيميائية التي قدمتها الهلام الأصلي ويمكن تعزيز مخزونات النشر الاستراتيجي 2D-الصفحة إلى حد كبير عندما جنبا إلى جنب مع بيانات من التقنيات الطيفية. بغض النظر عن النظام المستخدم، مشكلة مركزية مع استخدام المواد الهلامية الأصلية لتحديد المجمعات هو أنه يمكن دائماً الطعن في تحديد (أي، العثور على البروتينات في فرقة يمكن أن يمثل دائماً مجمعات كوميجراتينج أو مكوناتها، بدلاً من ذلك من مجمع فسيولوجيا أصيلة واحدة.) توصيف الطيفية يوفر المعلومات الفيزيائية الحيوية حول الأصباغ في نطاقات هلام الأخضر ويمكن استخدامها لتحديد ما هي أنواع المجمعات التي من المحتمل أن تحتوي على. الأسفار الكلوروفيل مفيد بشكل خاص في هذا الصدد نظراً لأطياف مختلفة إلى حد كبير غالباً وإعمار الأسفار التي تتميز بها مجمعات البروتين صبغات التمثيل الضوئي المختلفة. الحديثة فوتون واحد يرتبط وقت العد (تكسبك) بينما الأطياف fluorescence حالة ثابتة بسيطة ك 77 تاريخيا مفيدة في تأكيد هويات مجمعات جل الأصلي، يمكن أن توفر معلومات أكثر بكثير. تكسبك تسمح ليس فقط توصيف المجمعات استناداً إلى عمر الأسفار، ولكن أيضا يجعل من الممكن وصف مفصل لنقل الطاقة بين المكونات الطيفية داخل مجمع. أصبح ضروريا بصورة متزايدة كاستخدام هلام الأصلي مختلف نظم ينتشر هذا النوع من الوصف ومجمعات المفترضة جديدة يتم اكتشافها، يسمح بتحديد البروتين المجمعات مصادقة أفضل وتقديم الجديد المعلومات الفيزيائية الحيوية حول كيفية عمل هذه المجمعات.

في هذه الورقة نقدم أسلوب الذي يسمح للجهات الأخرى التي لها خبرة قليلة أو لا مع التفريد جل أصلي لتحقيق نوعية عالية القرار مجمعات ثايلاكويد الأصلية لغرض التحقيق وميكانيكا ردود فعل الضوء عملية التمثيل الضوئي. ويمكن زيادة هذه التقنية الأساسية ثم المجرب السلطة التقديرية لتحسين النتائج، أو توسيع نطاق تطبيقها على الأنواع الأخرى. ثم يصف لنا عملية إخضاع العصابات هلام الأخضر الأصلي تكسبك، فضلا عن بعض الخطوات للتحليل الأساسي والعرض التقديمي للبيانات المقدمة من هذه التقنية. ويمتد اقتران التفريد جل أصلي مع تحليل تكسبك الأداة المساعدة هذه الأنظمة الهلام بتوفير المصادقة وتوصيف الفيزيائية الحيوية للبروتين المجمعات داخل العصابات. هلام الأخضر الموصوفة هنا هو يستند النظام التي وضعتها ستاهلين والين¹⁷ مع إدخال بعض التعديلات عليها، وهو نفسه الذي يستخدم في شفارتز وآخرون. ²⁰-هذا النظام هو واحد من كثير لكن محددة من الميزات التي تعتبر مفيدة لهذه المنهجية. أنها سريعاً ما فيه الكفاية حتى أن ثايلاكويد العزلة وجل التفريد، وتكسبك تحليل مناسب يمكن أن يؤديها في يوم واحد، تفادي المشاكل المحتملة لتخزين العينات والتدهور. كما نجد أن هذا الأسلوب قوية في أيدي المستخدمين الذين تنقصهم الخبرة، في حين لا تزال تقدم النتائج التي تتراوح من جيدة إلى الأعلى، تبعاً لدرجة التحسين.

من المهم أن نضع في اعتبارنا أن المجمعات تصور في جل أصلية تعتمد على نظم كل من المنظفات والمخزن المؤقت المستخدمة، فضلا عن بيولوجيا الكائنات الحية تحت التحقيق. فصل مختلف النظم المنظفات والمخزن المؤقت تفضيلي أنواع مختلفة من المجمعات، وكائن التمثيل الضوئي معين سيكون مجمعات مختلفة من الكائنات الحية الأخرى، ليست جميعها سوف تكون موجودة تحت أي ظرف من الظروف. النظام المذكور هنا مناسبة خاصة لدراسة هذه المبادرة ميجاكومبليكسيس، كما هو موضح في شفارتز وآخرون. ²⁰، ولكن يقع على نهاية المزعزع للاستقرار أكثر من الطيف لأولئك الذين يدرسون ميجاكومبليكسيس بسيي. لإجراء دراسة شاملة لمختلف النظم المنظفات والمخزن المؤقت المستخدمة في التفريد جل أصلي من البروتينات ثايلاكويد، يوصي باستعراض Järvi وآخرون. ²¹ ورانتالا et al. ²².