ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות
Summary
כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).
Abstract
Erythroid תא מחויבות ובידול המשך ההפעלה של שושלת היוחסין מוגבלת לרשת תעתיק בניצוחו של קבוצה של גורל קביעת והתבגרותו גורמים. קודם לכן יצאנו כדי להגדיר את ערכת מינימלי של הגורמים הדרושים להדרכת התפתחות תאי הדם האדומים באמצעות ישיר לשושלת התכנות של fibroblasts לתוך erythroid המושרה אבות/מבשרי (iEPs). הראנו את ביטוי של Gata1, Tal1, Lmo2ו- c-Myc (GTLM) יכול במהירות להמיר מאתר ואנושי fibroblasts ישירות אל iEPs הדומים פיד ה בונה תאים erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים. בכוונתנו כי iEPs יספק כלי יקר ערך ללמוד אריתרופויזה ותא תקנה הגורל. כאן נתאר את תהליך stepwise המרת fibroblasts קצה הזנב מאתר iEPs דרך שעתוק מונחה גורם ישיר לשושלת התכנות (DLR). בדוגמה זו, אנו מבצעים את התכנות ב fibroblasts מן השושלת-עקיבה erythroid עכברים המבטאים החלבון הניאון צהוב (YFP) תחת השליטה של אריתרופויאטין קולטן ג’ין (EpoR) המקדם, המאפשר ויזואליזציה של תא erythroid אינדוקציה הגורל על התכנות. בעקבות פרוטוקול זה, שניתן לתכנת fibroblasts לתוך iEPs בתוך חמש עד שמונה ימים.
אמנם עדיין ניתן לבצע שיפורים לתהליך, אנו מראים כי בתיווך GTLM התכנות הוא תהליך מהיר וישיר, מניב תאים בעלי מאפיינים של פיד ה bona קדמון erythroid ותאי מבשר.
Introduction
תאי דם אדומים (RBCs) חיוניים כל החולייתנים ותשלימו 84% של כל התאים של הגוף האנושי1 מעובריים לחיים הבוגרים, הבריאות שלנו תלויה מאוד מדויק ההסדרה של RBC הומאוסטזיס. ייצור שוטף של בוגר RBCs במהלך פיתוח לבגרות מכונה אריתרופויזה. האתגר העיקרי במחקר אריתרופויזה הוא להגדיר הרגולטורים מאסטר זה שננהל את התפתחות RBC והבורר בין אריתרופויזה פרימיטיביים ומוחלטת. השושלת ישירה התכנות של אבות erythroid מהווה הזדמנות להבין עוד יותר erythroid פיתוח בתוך vivo.
השושלת ישירה התכנות (DLR), הידוע גם בשם transdifferentiation, הוא התהליך של התכנות סוג תא אחד ישירות לתוך אחר, תוך עקיפת pluripotent ושלבים קדמון multipotent. DLR שימש עד כה כדי לייצר סוגי תאים רבים כולל עצבית2,4,hematopoietic3,5, הכבד6 נפרוטית7, ובתאים. עבור ביולוגים התפתחותיים, DLR הפך כלי חשוב חוקר היבטים של שושלת היוחסין ומחויבות התמיינות סופנית תהליכים8,9. DLR ניתן להשלים ולהחליף חלקית ויוו ללימודי הבנה מנגנונים של גורל לקביעת גורמים במהלך הפיתוח. פרוטוקול DLR עבור התכנות אבות erythroid המתואר במאמר זה מספק השדה שיטה ללא תשלום עבור מחקרים התפתחותיים של אריתרופויזה.
בעבר הראו כי ביטוי קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר והן אנושיים ישירות אל erythroid המושרה אבות (iEPs) 10. erythroid היו GTLM תאים דומים במידה רבה bona פיד ה אבות erythroid פרימיטיבית במובן של ביטוי של מורפולוגיה, פנוטיפ, ג’ין-10. לפיכך iEPs מוגבלת יכולת התפשטות, התבגרת. דומים לאלו transiently מיוצר העובר מוקדם לפני התחלתה של אריתרופויזה סופית nucleated אריתרוציטים. על-ידי ביצוע שינויים בתנאים התיכנות (למשל, נקודת מוטציות בגן התכנות גורמים או גורמים אחרים), אפשר להבין איך זה יוביל לשינויים erythroid פיתוח ובידול. אנחנו למשל הראו כי תוספת של Klf1 או Myb GTLM במסיבת הקוקטייל משתנה התבנית ביטוי גלובין בעיקר עובריים (פרימיטיבי) כדי בעיקר למבוגרים (סופית). ממצא זה מאשר את החוקיות של השימוש DLR ככלי להגדרת גורמים התפתחותיים ב אריתרופויזה.
כאן, אנחנו חלוקה לרמות את התהליך של יצירת iEPs של עכבר זנב עצה fibroblasts (TTF). התוצאות נציג שלנו, ביצענו את התכנות על fibroblasts מן העכברים שושלת היוחסין-עקיבה erythroid (Epor– Cre R26– eYFP) אשר אקספרס החלבון הניאון צהוב (eYFP) של לוקוס Rosa26 כל התאים את זה הביעו את הקולטן אריתרופויאטין, המאפשר ויזואליזציה קל של מחויבות השושלת erythroid. באמצעות שיטה זו, YFP חיובי (EpoR +) תאים נוכחים מוקדם ככל חמישה ימים לאחר התמרה חושית. פרוטוקול זה, מציע לכן, טכניקה חזקה ומהירה לדור של erythroid אבות במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביטוי של קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר ואנושי ישירות אל iEPs10. התאים היו erythroid דמה מאוד בונה פיד ה אבות erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים ויכולת המושבה יוצרי. ממצא זה אם יא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אוולין וואנג והייד גרגורי (מכון וייטהד, Cambridge, MA) על שיבוט, הארווי Lodish (מכון וייטהד) למתן רבים פלסמידים משמש ליצירת ספריית retroviral. אנו מודים Kavitha Siva, סופי Singbrant (המחלקה לרפואה מולקולרית, ריפוי גנטי, אוניברסיטת לונד), גוראן קרלסון, סאנג’י שמיט (המחלקה להמטולוגיה מולקולארית, אוניברסיטת לונד) על תפקידיהם בתיאור של ייצור iEP. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ג’וליאן Pulecio (מרכז של רפואה רגנרטיבית, ברצלונה פארק מחקר ביו-רפואית), ויולטה זהורית-אסטרדה (רוקפלר אוניברסיטה, ניו יורק), קארל Walkley (המכון למחקר רפואי סנט וינסנט, מחלקת רפואה, בית החולים סנט וינסנט, אוניברסיטת מלבורן), רעיה אנחל (קטלאנית במוסד לחולי ומחקר ללימודים מתקדמים, ברצלונה), ענבר G. עמי הולצמן (מכון רחבה של מכון מסצ’וסטס של טכנולוגיה, הרווארד, קיימברידג ) על תרומתם קודמת לעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי קרן Söderberg רגנר (כדי ג’יי); מחקר שוודי המועצה (כדי ג’יי); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (כדי ג’יי); העמותה השבדית לחקר אסטרטגי (כדי ג’יי); הקרן של אקא Wiberg (כדי ג’יי); מענק אינטגרציה מארי קירי (כדי ג’יי).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
