Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen
Summary
Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).
Abstract
Erythroid cel inzet en differentiatie doorlopen activering van een bloedlijn-beperkte transcriptionele netwerk georkestreerd door een groep van het lot van de cel bepalen en factoren rijpen. We eerder uiteengezet te definiëren de minimale benodigde factoren voor het instrueren van de rode bloedcellen ontwikkelen met behulp van directe bloedlijn herprogrammering van fibroblasten in geïnduceerde erythroid progenitoren/precursoren (iEPs). We toonden dat overexpressie van Gata1, Tal1, Lmo2en c-Myc (GTLM) kunnen snel converteren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks aan iEPs die lijken op de bona fide erythroid cellen in termen van morfologie, fenotype, en genexpressie. Wij zijn van plan dat iEPs een instrument van onschatbare waarde om te studeren Erytropoëse en cel lot verordening zal bieden. Hier beschrijven we de stapsgewijze proces van het omzetten van lymfkliertest staart tip fibroblasten in iEPs via transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR). In dit voorbeeld voeren wij de herprogrammering in fibroblasten van erythroid afkomst-tracing muizen die uitdrukking geven aan de gele fluorescerende proteïne (YFP) onder de controle van de Erytropoëtine receptor gen (EpoR) promotor, visualisatie van erythroid cel inschakelen lot inductie op herprogrammering. Naar aanleiding van dit protocol, fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in iEPs binnen vijf tot acht dagen.
Terwijl verbeteringen kunnen nog steeds worden gemaakt aan het proces, laten we zien dat GTLM-gemedieerde herprogrammering is een snelle en directe proces, opbrengst van cellen met eigenschappen van bona fide erythroid voorlopercellen en voorloper cellen.
Introduction
Rode bloedcellen (RBC) zijn essentieel in alle gewervelden en make-up 84% van alle cellen van het menselijk lichaam1. Van embryonale tot volwassen leven is onze gezondheid sterk afhankelijk van de exacte regeling van RBC homeostase. De voortdurende productie van rijpe RBC in de gehele ontwikkeling naar volwassenheid staat bekend als de Erytropoëse. Een belangrijke uitdaging in de Erytropoëse onderzoek is vast te stellen van de master toezichthouders dat ontwikkeling van de RBC en de switch tussen primitieve en definitieve Erytropoëse orkestreren. Directe bloedlijn herprogrammering van erythroid voorlopercellen biedt een kans om verder te begrijpen erythroid ontwikkeling in vivo.
Directe bloedlijn herprogrammering (DLR), ook bekend als transdifferentiatie, is het proces van herprogrammering één celtype rechtstreeks naar de andere, het omzeilen van pluripotente en multipotente voorlopercellen stadia. DLR heeft tot nu toe is gebruikt voor de productie van vele celtypes, met inbegrip van neurale2, hematopoietische3,4,5, hepatische6 en nefrotisch7, voorlopercellen. Voor ontwikkelingsstoornissen biologen, DLR uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor Larive aspecten van lineage inzet en terminal differentiatie processen8,9. DLR kan aanvullen en gedeeltelijk vervangen in vivo studies voor het begrijpen van mechanismen van het lot van de cel bepalende factoren tijdens de ontwikkeling. De DLR-protocol voor de herprogrammering te erythroid progenitoren beschreven in dit document levert het veld een gratis methode voor bestudering van de ontwikkelings van de Erytropoëse.
Wij hebben eerder aangetoond dat overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), voldoende om te herprogrammeren van zowel menselijke als lymfkliertest fibroblasten rechtstreeks naar geïnduceerde erythroid voorlopercellen (iEPs) 10. the GTLM-geherprogrammeerd erythroid cellen lijken sterk op bona fide primitieve erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype en gen expressie10. Dus iEPs hebben beperkte capaciteit van de proliferatie en vervallen en genucleëerde vergelijkbaar zijn met die Transient geproduceerd in het vroege embryo vóór aanvang van de definitieve Erytropoëse erythrocyten. Door wijzigingen in de herprogrammering voorwaarden (bijvoorbeeld puntmutaties in herprogrammering factoren of toevoeging van andere factoren), kan men begrijpen hoe dit leidt tot veranderingen in de erythroid ontwikkeling en differentiatie. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat toevoeging van Klf1 of Myb aan de cocktail GTLM het globine-expressiepatroon van overwegend embryonale (primitieve verandert) vooral volwassen (definitieve). Deze bevinding bevestigt de geldigheid van het gebruik van DLR als een instrument voor het definiëren van ontwikkelingsstoornissen factoren in de Erytropoëse.
We schetsen hier, het proces van het genereren van iEPs van muis staart tip fibroblasten (TTF). In onze representatieve resultaten, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor– Cre R26– eYFP) die express de gele fluorescerende proteïne (eYFP) van de Rosa26 locus in alle cellen die geuit de Erytropoëtine-receptor, waardoor eenvoudige visualisatie van betrokkenheid bij de erythroid afkomst. Met behulp van deze methode, zijn positieve YFP (EpoR +) cellen aanwezig zo spoedig vijf dagen na transductie. Dit protocol, daarom biedt een snelle en robuuste techniek voor de generatie van erythroid voorlopercellen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), is voldoende om te herprogrammeren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks naar iEPs10. De cellen geherprogrammeerde erythroid leek sterk op bona fide erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype, genuitdrukking en kolonievormend vermogen. Deze bevinding bevestigt de grondgedachte van…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Evelyn Wang en Gregory Hyde (Instituut Whitehead, Cambridge, MA) voor klonen en Harvey Lodish (Instituut Whitehead) voor het verstrekken van veel van de plasmiden gebruikt voor het genereren van de retrovirale bibliotheek. Wij danken Kavitha Siva en Sofie Singbrant (afdeling van moleculaire geneeskunde en Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson en Shamit Soneji (departement voor moleculaire hematologie, Lund University) voor hun rollen in beschrijving van iEP productie. Wij willen ook te erkennen en dank Julian Pulecio (centrum voor regeneratieve geneeskunde, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent’s Instituut voor medisch onderzoek en Vakgroep Geneeskunde, St Vincent’s Hospital, Universiteit van Melbourne), Ángel Raya (Catalaanse instelling voor onderzoek en geavanceerde Studies, Barcelona) en Vijay G. Sankaran (Broad Instituut van het Massachusetts Institute of Technology en Harvard, Cambridge ) voor hun vorige bijdrage aan dit werk. Dit werk werd gesteund door de Ragnar Söderberg Stichting (JF); het Zweedse onderzoek Raad (aan J.F.); Stichting Olle Engkvist Byggmästare (aan J.F.); de Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek (JF); Åke Wiberg van Stichting (JF); een toekenning van de integratie Marie Curie (aan J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
