Прямые, Lineage перепрограммирование взрослых мыши фибробластов в эритроидные предшественники
Summary
Здесь мы представляем наши протокол для производства индуцированной эритроидные предшественники (ПРП) от взрослых фибробласты мыши с помощью транскрипции управляемый фактор прямой линии перепрограммирования (DLR).
Abstract
Эритроидных клеток приверженность и дифференциации перейти через активацию линии ограничена транскрипционный анализ сети, организованные группы клеток судьбы, определение и созревания факторов. Ранее мы намерены определить минимальный набор факторов, необходимых для инструктажа развития красных кровяных клеток, используя прямой линии перепрограммирования фибробластов в индуцированной эритроидные предшественники/прекурсоров (ПРП). Мы показали что Сверхэкспрессия Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc (GTLM) можно быстро преобразовать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП, которые напоминают bona fide эритроидные клетки с точки зрения морфологии, фенотип, и экспрессии генов. Мы планируем, что ПРП будет предоставлять бесценным инструментом для изучения эритропоэза и клетка судьба регулирования. Здесь мы описываем процесс поэтапного преобразования мышиных хвостовой оконечности фибробластов в ПРП через транскрипционным фактором driven прямой линии перепрограммирования (DLR). В этом примере мы выполняем перепрограммирования в фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные, которые выражают желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) под контролем промотора гена (EpoR) рецепторов эритропоэтина, позволяя визуализации эритроидные клетки Судьба индукции после перепрограммирования. После этого протокола фибробласты могут быть перепрограммированы в ПРП в течение пяти до восьми дней.
В то время как еще можно улучшить процесс, мы показывают, что GTLM-опосредованной перепрограммирования быстрый и прямой процесс, уступая клетки с свойствами bona fide эритроидные клетки предшественники и прекурсоров.
Introduction
Красные кровяные клетки (эритроциты) важны для всех позвоночных и составляют 84% от всех клеток тела человека1. Из эмбриональных к взрослой жизни наше здоровье сильно зависит от точной регуляции гомеостаза РБК. Текущего производства зрелых эритроцитов на протяжении развития в зрелом возрасте известен как эритропоэза. Серьезной проблемой в эритропоэза исследования заключается в определении главных регуляторов, которые оркестровать РБК развития и переключение между примитивными и окончательного эритропоэза. Прямой линии перепрограммирование эритроидные предшественники представляет возможность для более глубокого понимания эритроидные развития в естественных условиях.
Прямой линии перепрограммирования (DLR), также известный как transdifferentiation, является процесс перепрограммирования один тип ячейки непосредственно в другой, минуя плюрипотентных и Multipotent с прародителем этапов. DLR до настоящего времени был использован для создания многочисленных типов клеток, включая нейронные2, гемопоэтических3,4,5, печеночная6 и нефротическим7, клетки-предшественники. Для развития биологов DLR стал важным инструментом для допрос аспекты приверженность линии и терминала дифференциация процессы8,9. DLR может дополнять и частично заменить в vivo исследований для понимания механизмов судьбы клетки, определяющих факторов во время разработки. DLR протокол для перепрограммирования эритроидные предшественники, описанных в данном документе предоставляет поле бесплатный метод для развития исследований эритропоэза.
Ранее мы показали, что гиперэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к индуцированных эритроидные предшественники (ПРП) 10. GTLM-перепрограммирование эритроидных клеток сильно напоминают bona fide примитивных эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип и ген выражение10. Таким образом ПРП имеют ограниченный потенциал распространения и зрелые ядерных эритроцитов аналогичны временно производится в начале эмбриона до начала окончательного эритропоэза. Внеся изменения в перепрограммирования условиях (например, точечные мутации в перепрограммировании факторов или добавление других факторов), можно понять как это приводит к изменениям в развитии эритроидные и дифференциации. Мы например показали, что добавление Klf1 или Myb на GTLM коктейль изменяет Глобин выражения от преимущественно эмбриональных (примитив) в основном взрослых (окончательный). Этот вывод подтверждают обоснованность использования DLR в качестве инструмента для определения развития факторов в эритропоэза.
Здесь мы приводим процесс генерации ПРП от мыши хвостовой оконечности фибробластов (TTF). В результаты нашего представителя, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor– Cre R26– eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентный белок (eYFP) от Rosa26 Локус во всех клетках, выразили рецепторов эритропоэтина, позволяя легко визуализации приверженность линии эритроидные. С помощью этого метода, рекламы ЯФП позитивные (EpoR +) клетки присутствуют пять дней после передачи в кратчайшие сроки. Этот протокол, таким образом, предлагает быстрый и надежный метод для генерации эритроидные предшественники в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сверхэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП10. Перепрограммировать эритроидных клеток сильно напомина?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эвелин Ван и Грегори Хайд (Институт Уайтхед, Кембридж, Массачусетс) для клонирования и Харви Lodish (Уайтхед институт) за предоставление многих плазмид, используется для генерации ретровирусной библиотеки. Мы благодарим Кавитха Шивы и Sofie Singbrant (Кафедра молекулярной медицины и генной терапии, Лундский университет), Гёран Карлссон и Shamit Soneji (Отдел молекулярной гематологии, Лундский университет) за их роль в описании iEP производства. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить Julian Пулесьо (Центр восстановительной медицины, Барселона биомедицинская научно-исследовательский парк), Виолета района-Эстрада (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк), Карл Walkley (Сент-Винсент институт медицинских исследований и Кафедра медицины, Сент-Винсент больницы, Университет Мельбурна), Анхель рая (каталонский Институт передовых исследований, Барселона) и Vijay G. Sankaran (широкой институт Массачусетского института технологии и Гарвардского университета, Кембридж ) для их предыдущий вклад в эту работу. Эта работа была поддержана Рагнар Söderberg фонда (J.F.); Шведские исследования Совета (к J.F.); Стифтельсен Олле Engkvist Byggmästare (к J.F.); Шведский фонд стратегических исследований (к J.F.); Åke Wiberg фонд (к J.F.); Мари Кюри интеграции Грант (J.F.).
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
