Summary

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

Published: December 10, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour exprimer les protéines dans des protoplastes à l’aide de la méthode de transformation par PEG. La méthode fournit une expression simple de protéines d’intérêt et un examen efficace de la localisation de la protéine et le processus d’importation pour diverses conditions expérimentales in vivo.

Abstract

Le chloroplaste est un organite indispensable qui est responsable de divers processus cellulaires chez les plantes, comme la photosynthèse et la production de nombreux métabolites secondaires et les lipides. Chloroplastes nécessitent un grand nombre de protéines pour ces différents processus physiologiques. Plus de 95 % de protéines de chloroplastes sont noyau codé et importés dans des chloroplastes du cytosol après traduction sur des ribosomes cytosoliques. Ainsi, l’importation appropriée ou le ciblage de ces protéines chloroplastiques noyau codé aux chloroplastes est essentiel au bon fonctionnement des chloroplastes ainsi que la cellule végétale. Chloroplaste noyau codé protéines contiennent des séquences signal pour un ciblage spécifique aux chloroplastes. Les machines moléculaires localisé dans les chloroplastes ou cytosol reconnaître ces signaux et mener le processus d’importation. Afin d’étudier les mécanismes d’importation de protéines ou de ciblage aux chloroplastes in vivo, nous avons développé une méthode rapide et efficace axée sur les protoplastes pour analyser l’import des protéines dans des chloroplastes d’Arabidopsis. Dans cette méthode, nous utilisons des protoplastes isolés de tissus foliaires d’Arabidopsis. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier le mécanisme par lequel les protéines sont importés dans des chloroplastes.

Introduction

Le chloroplaste est l’un des principaux organites chez les plantes. Une des fonctions principales des chloroplastes est de réaliser la photosynthèse1. Chloroplastes accomplissent également de nombreuses autres réactions biochimiques pour la production d’acides gras, acides aminés, nucléotides et de nombreux métabolites secondaires1,2. Pour toutes ces réactions, les chloroplastes nécessitent un grand nombre de différents types de protéines. Toutefois, le génome chloroplastique contient seulement environ 100 gènes3,4. Par conséquent, les chloroplastes doivent importer la majorité de leurs protéines du cytosol. En fait, la plupart des protéines de chloroplastes ont été montrés à être importé du cytosol après traduction4,5,6. Les cellules végétales nécessitent des mécanismes spécifiques pour importer les protéines du cytosol vers chloroplastes. Cependant, bien que ces mécanismes d’importation de protéines ont été étudiées pour les dernières décennies, nous ne comprends toujours pas pleinement leur au niveau moléculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour la préparation des protoplastes et exogène exprimant des gènes dans des protoplastes. Cette méthode pourrait être utile pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents import des protéines dans des chloroplastes en détail.

Import des protéines peut être étudié à l’aide de différentes approches. Une de ces méthodes implique l’utilisation d’un in vitro protéine importation système7,8. En utilisant cette approche, en vitro-précurseurs de protéines traduites sont incubés avec chloroplastes purifiée in vitro, et import des protéines est analysée par SDS-PAGE, suivie par l’analyse par western blot. L’avantage de cette approche est que chaque étape de l’import des protéines dans des chloroplastes peut être étudié en détail. Ainsi, cette méthode a été largement utilisée pour définir les composants de la machinerie moléculaire de protéine importation et disséquer les informations de séquence pour les peptides de transit. Plus récemment, une autre approche impliquant l’utilisation de protoplastes de tissus foliaires a été développée et il a devenu employé couramment pour étudier l’importation de protéines dans les chloroplastes9,10. L’avantage de cette approche est que les protoplastes fournissent un environnement cellulaire qui est plus proche de celle des cellules intactes que le système in vitro . Ainsi, le système de protoplaste nous permet d’aborder de nombreux autres aspects de ce processus, tels que les événements cytosoliques associés et comment la spécificité du ciblage des signaux est déterminé. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier l’import des protéines dans des chloroplastes.

Protocol

1. la croissance des plantes Arabidopsis Préparer 1 L Gamborg B5 (B5) moyen en ajoutant 3,2 g de milieu B5 y compris les vitamines, 20 g de saccharose, 0,5 g de 2-(N-morpholino) éthane sulfonique (MES) à environ 800 mL d’eau désionisée et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter plus désionisée eau porter le volume total de 1 L. ajouter 8 g de phytoagar et stériliser pendant 15 minutes à 121 ° C. Laisser le milieu à refroidir à 55 ° C et verser 20 à 25 mL de …

Representative Results

L’importation de protéines dans les chloroplastes peut être examinée à l’aide de deux approches : analyse de microscopie et immuno fluorescence après séparation véhiculée par SDS-PAGE. Ici, nous avons utilisé des globules rouges-nt:GFP, une fusion construire codant les 79 résidus d’acides aminés N-terminaux de globules rouges contenant le peptide de transit fusionné à la GFP. Lorsque les protéines sont importés dans des chloroplastes, fluorescence verte des signaux d…

Discussion

Nous avons fourni un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’ Arabidopsis pour étudier l’import des protéines dans des chloroplastes. Cette méthode est puissante pour étudier le processus d’importation de protéines. Cette technique simple et versatile est utile pour examiner le ciblage des protéines cargo destiné aux chloroplastes. En utilisant cette méthode, protoplastes sont préparés à partir des tissus foliaires de Arabidopsis11,<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été réalisée avec le soutien du programme de recherche coopérative pour les sciences de l’Agriculture et le développement technologique (projet No PJ010953012018), Administration du développement Rural et la subvention de la National Research Foundation (Corée) financé par le ministère de la Science et de la TIC (no 2016R1E1A1A02922014), République de Corée.

Materials

GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS Duchefa Biochemie G0210.0050
SUCROSE Duchefa Biochemie S0809.5000
MES MONOHYDRATE Duchefa Biochemie M1503.0250
Agar, powder JUNSEI 24440S1201
Micropore Surgical tape 3M 1530-0
Surgical blade stainless No.10 FEATHER Unavailable
Conical Tube, 50ml SPL LIFE SCIENCES 50050
Macerozyme R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
Cellulase ONOZUKA R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
ALBUMIN, BOVINE (BSA) VWR 0332-100G
D-Mannitol SIGMA M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE MP BIOMEDICALS 0219463505-5KG
Twister VISION SCIENTIFIC VS-96TW
Screen cup for CD-1 SIGMA S1145
Screens for CD-1 SIGMA S3895
Petri Dish SPL LIFE SCIENCES 10090
Pasteur pipette HILGENBERG 3150102
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP VISION SCIENTIFIC VS-5500N
Sodium chloride JUNSEI 19015S0350
Potassium chloride SIGMA P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS BIO BASIC GB0219
Potassium Hydroxide DUKSAN 40
Calcium nitrate tetrahydrate SIGMA C2786-500G
Poly(ethylene glycol) SIGMA P2139-2KG
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA M2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PP SARSTEDT 55.515
Microscope slides MARIENFELD 1000412
Microscope Cover Glasses MARIENFELD 101030
Counting Chamber MARIENFELD 650030
Axioplan 2 Imaging Microscope Carl Zeiss Unavailable
Micro tube 1.5ml SARSTEDT 72.690.001
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade VWR M107-500G
TRIS, Ultra Pure Grade VWR 0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade VWR 0281-25G
Bromophenol blue sodium salt ACS VWR 0312-50G
Glycerol JUNSEI 27210S0350
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) TAKARA 632381

References

  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

Play Video

Citer Cet Article
Lee, J., Kang, H., Hwang, I. Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts. J. Vis. Exp. (142), e58441, doi:10.3791/58441 (2018).

View Video