ここでは、生物学的および生物医学研究のモデル人間の肺疾患に 3 D 肺組織文化の生成に適している患者の切除から肺癌 agarose 充填精度カット スライスの準備のためのプロトコルを提案する.
人間の病気発見の小説の翻訳は、病気の人間組織モデルの可用性によって制限されます。精密カット肺スライス (PCL) 3 D 肺組織培養 (3 D-Ltc) をエレガントな表現として使用と関連性の高い生物学的 3 D 細胞培養モデル、非常に類似しているその複雑さ、バイオメカニクスのためその場で組織・分子組成物。組織スライスは、様々 な動物モデルで広く適用されます。人間 PCL から派生した 3 D Ltc は、メカニズムと人間の組織に薬の機能効果を理解するために役立つさらに新薬、レスポンスを分析する使用できます。PCL の肺切除を経験、患者の切除肺の組織サンプルからの準備は、病気のアクセシビリティとリンパを向上します。ここでは、切除軟弾性患者の肺組織から人間の PCL の生成のための詳しいプロトコルについて述べる.アガロースは、このように肺構造を維持し、その後スライスにとって重要である組織の硬さの増加、resectates の肺胞領域に導入されました。500 μ m の厚さのスライスを vibratome と組織ブロックから作製した.PCL から生検パンチはサンプル サイズに匹敵する組織を確保する、組織サンプルの量をさらに増やします。生成された肺組織文化は、さまざまなひと肺生物学、病態とその最高の状態で (サブ-) 細胞レベルで線維化のプロセスなど、さまざまな病気のメカニズムなどの研究に適用できます。モデル前のヴィヴォ3 D LTC の最大のメリットは 3 D の組織構造, 細胞タイプの多様性肺の解剖学と個々 の患者からのティッシュの評価の可能性についてその場で人間の肺をその近くに表現します。さらに精度の薬のための新しい戦略を開発するものです。
慢性および急性肺疾患は、罹患率と死亡率世界1の主要な原因です。びまん性の実質性肺疾患5肺がん4重度の喘息3閉塞性肺疾患 (COPD)2のような慢性肺疾患を持つ患者の根治的治療、現在利用できません。肺疾患の動物モデルでの研究疾患病因6の理解を深めたし、潜在的な新規治療標的7,8,9, 識別につながっているがこれらのモデルは、関連する生物学的および生理学的な違い人間10と比較して展示します。マウスおよびひと生物学と解剖学、生体 3 D 肺組織培養 ex 人間間のこれらの矛盾を克服するために (3 D-LTC) システムは、生物医学研究のさまざまな領域で使用されます。これらの 3 D LTC 培養システムは、精密カット肺のスライス (PCL) に基づいています。前のヴィヴォ PCL の世代全体肺胞や気道11、間質、血管内細胞の空間と機能の関係の調査では、3 番目の空間の次元の分析が可能と中皮。特に、ex vivo モデル PCL が多細胞、その場で肺の最も機能的な細胞が含まれていることを意味、従って細胞のネイティブの生物学的環境を密接に表す、従って限られた細胞とほとんど 2 D 細胞マトリックス相互作用を克服します。細胞培養に近づきます。今まで前のヴィヴォ マウス PCL 使用されてモデル肺疾患, COPD12, 肺線維症13、肺がん14、ウイルス感染15,16, 気管支肺異形成症17のような喘息18。しかし、臨床試験で調べたひと肺疾患における新規薬物療法のかなりの割合翻訳しないでくださいの有効性や安全性の欠如に起因する診療所に assumingly ため人間間違いをかなりまだとマウス生物学と疾患19,20,21。
数年間、人間の PCL を主化学薬品および薬剤の肺毒性を評価するために使用されています。ごく最近、ひと肺組織は、病態生理学的および薬理学的研究を追求する COPD22,23, 喘息の24、および肺線維症25、患者から使用されています。切除患者臓器材料を利用して PCL の生成を表すと器官のネイティブの細胞多様性のほとんどを維持することの複雑な 3 D 組織環境22の主要な病気の認刻極印を要約 1 つ等。また、多様な実験のセットアップで適用される病気の組織は、肝臓、腸管、腎臓26,27,28,29病様変化を模倣する示されました。
ただし、いくつかの理由のため肺組織の処理、やりがいのままです。固体組織とは異なりネイティブ肺換気なしで崩壊するがちで、下部組織の剛性を展示します。これらのプロパティは、組織のスライスを妨げます。したがって、気道やポイントの低融点アガロースと肺胞腔の充填はネイティブの肺構造を維持し、マウスおよびひと肺30の精密カット スライスに必要な剛性を提供します。研究目的のため寄付ひと肺 resectates が本来の解剖学的、遺伝的、生理学的高度多様な従って実験25を実行するとき多くの場合高い患者間の可変性を提示します。全葉または全肺植と対照をなして胸部外科による切除肺サンプルは必ずしも解剖学的セグメントに従う、したがって、特別な準備が必要。この資料では、モデル肺疾患切除肺組織、その後栽培・実験用から人間の PCL の世代の詳細かつ最適化されたプロトコルを提供します。
本稿で説明されたプロトコルは、液体アガロースと後続の vibratome スライスで塗りつぶすことによりひと肺組織 resectates から PCL の世代をカバーしています。組織スライスの世代は、これらの器官の固有の剛性はそのまま組織のスライスを直接許可、肝臓や脳などの臓器のカップルのため前に示されました。注記のうち、肺組織の初期の適切な準備は、PCL を生成する際に最も重要なステップです。肺の Agarose の充填は、選択はその柔らかく、弾性の性質を安定させるために、同種で再現可能な PCL の世代を確保するための方法です。肺癌組織の大きい航空路、小気道だけでなく、そのまま肺実質へのアクセスを提供する cannulated します。充填アガロースはほぼ不可能になります、そのまま胸膜の欠如は、肺は肺をスライスするために使用可能なほとんどない主要な理由です。前向き、もともと脱足場の機能の実験を行うため合成胸膜は成功したアガロース充填不足そのまま胸膜31外植体を達成するために可能性があります適用でした。そのまま胸膜とひと肺組織部分の切除がティッシュをスライスするためのブロックを生成するために不可欠です。切除は完全にそのまま葉や肺移植を受けた患者の全肺植よりも腫瘍組織がん切除からのため利用可能です。
一般的には、2 つのシステムは、PCL を生成に使用される: Krumdieck 組織スライサー15と振動ミクロトーム (vibratomes)。組織スライサーは、この船の終わりに 90 ° で、PCL を切る金属容器を組織ブロックを通過してスライスを生成します。Vibratomes 振動を移動することによって PCL を生成する組織に以下のせん断力を発揮する Krumdieck スライサーに比べて冷却中お風呂に浸漬する組織の固定ブロックを水平にナイフ。栽培する前に組織の少ない過酷な治療でこの結果します。その一方で、vibratome 切断は多くの時間と作業を消費です。私たちの手でスライス有効な最大 100 PCL または 500 PCL の生産 vibratome は 1 日、最も実験的研究のために十分にパンチします。PCL は、さまざまな方法で培養することができます: (a) (b) 動的な器官培養 (DOC) として (ALI) システム、トランス-井戸空気液体インターフェイスを生成するのに添付または (c) 標準的な培養条件で細胞培養液に浸漬します。PCL の詳細には、栽培された前述の22,23,25;しかし、世界中の様々 な研究所での使用の間の栽培条件の一般的な標準はまだ不足しています。特に、培養時間は重要な可能性があります: 144 時間後、120 h22後マウス PCL のように SFTPC 2 肯定的な肺胞型細胞の損失が観察されます。加えて、代謝活性はマウス22と人間 PCL25 120 h が安定するようです。
PCL の世代のためにいくつかの技術的な制限があります: 時間とともに変動する数と、resectates のサイズ得られた組織内そのまま胸膜の存在によって決まる、充填、アガロースの効率 PCL の世代の最終的な成功を決定します。(病気) の得られた肺組織内病変による組織破壊が PCL 準備を妨げる可能性があります。気道閉塞とそのまま歯槽スペースに欠けている線維組織充填の agarose が付いて阻害して線維化組織の要求の厳しいタスクをスライスします。気腫性の組織は、COPD やアルファ 1-抗トリプシン欠損の充填、アガロースの圧力に耐える可能性がありますいない肺胞や建築工芸品の破断になりますよう病気の発見します。これらのケースで低 agarose 濃度、1% (w/v) を、などの使用量は圧力を減少させ、アガロース充填時スピード役に立つかもしれない。全体的にみて、組織の病気の状態は劇的に PCL 生成のための組織の利用を制限できます。これらすべてのパラメーターは、肺組織から生成することができる PCL の量を決定する、また、時間のかかる、PCL を生成します。さらに PCL の制限、さらに実験のための正規化の手順を必要とするサイズや組織のコンテンツに関して異なる肺のスライスの間に不整合であります。これを克服するためには、同じスライスの類似した領域の生検パンチを生成できます。この手順は、組織の変動を軽減し、追加のメリットとして実験に使用することができます PCL サンプルの数を増やす傾向があります。
結論としては、アガロースから人間の 3 D 肺組織文化いっぱい PCL 肺の生理と疾患を勉強するため複雑な人体モデルを提供します。プロトコルは肺癌組織およびその栽培から PCL の準備の詳細な説明、またひと肺切除とどのようにそれらを克服する agarose 充填での課題に対応します。
The authors have nothing to disclose.
著者は、専門家の技術援助の魔理沙のノイマンに感謝しています。すべての肺組織は親切 CPC M バイオ アーカイブによってを提供されます。この作品は、肺研究 (dzl と)、ヘルムホルツ協会、CPC 研究学校補助金のドイツ センターによって支えられました。
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |