Nous présentons ici un protocole pour la préparation de tranches de poumon de coupe de précision humain rempli d’agarose de tissus réséqués du patient qui sont aptes à produire des cultures de tissus pulmonaires 3D aux maladies pulmonaires humaines modèle dans études biologiques et biomédicales.
Traduction de nouvelles découvertes à la maladie humaine est limitée par la disponibilité des modèles axée sur les tissus humains de la maladie. Tranches de coupe de précision du poumon (CIP) utilisées comme cultures de tissus pulmonaires 3D (3D-SFLC) représentent un cadre élégant et modèle de culture cellulaire 3D biologiquement très pertinentes, qui ressemblent fortement à des tissus sur place en raison de leur complexité, biomécanique et moléculaires composition. Découpage de tissu est largement appliqué dans divers modèles animaux. 3D-SFLC dérivé PCLS humaine peut être utilisé pour analyser les réponses à nouveaux médicaments, qui pourraient encore aider à mieux comprendre les mécanismes et les effets fonctionnels de drogues dans les tissus humains. La préparation de PCLS d’échantillons de tissus réséqués chirurgicalement pulmonaires des patients, qui ont connu la lobectomie pulmonaire, augmente l’accessibilité des malades et les tissus péri-tumoral. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la génération de PCLS humaine de tissus réséqués chirurgicalement soft-élastique patients pulmonaires. Agarose a été introduit dans l’espace de broncho-alvéolaire de la resectates, donc préservant la structure des poumons et augmente la rigidité du tissu, qui est cruciale pour le tranchage ultérieur. tranches de 500 µm d’épaisseur ont été préparés depuis le bloc de tissu avec un vibratome. Poinçons de biopsie de PCLS assurer tissu comparable tailles d’échantillon et augmentent la quantité d’échantillons de tissus. Les cultures de tissus pulmonaires généré peut être appliqués à une variété d’études en biologie du poumon humain, y compris la physiopathologie et les mécanismes des différentes maladies, telles que les processus fibrotiques à ses niveaux cellulaire au (sous-). L’avantage plus élevé du modèle 3D-LTC ex vivo est sa représentation proche du poumon humain in situ en ce qui concerne l’architecture 3D tissus, diversité de type cellulaire et anatomie du poumon ainsi que le potentiel pour l’évaluation des tissus de patients individuels, qui est pertinent développer de nouvelles stratégies pour la médecine de précision.
Maladies pulmonaires chroniques et aiguës sont une cause majeure de morbidité et mortalité dans le monde1. Pour les patients atteints de maladie pulmonaire chronique comme la maladie pulmonaire obstructive (BPCO)2, asthme sévère3, poumon cancer4 et diffus parenchymateuses pulmonaires maladies5, thérapies curatives ne sont actuellement pas disponibles. Bien que des études sur des modèles animaux de maladies pulmonaires ont approfondi la compréhension des maladies pathomécanismes6 et ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles7,8,9, ces modèles présentent des différences biologiques et physiologiques pertinentes par rapport aux hommes10. Pour surmonter ces divergences entre biologie murine et humaine, mais aussi, l’anatomie humaine ex vivo culture de tissu pulmonaire 3D (3D-LTC) systèmes sont utilisés dans divers domaines de la recherche biomédicale. Ces systèmes de culture 3D-LTC reposent sur des tranches de coupe de précision du poumon (CIP). La génération de PCLS ex vivo permet l’analyse de l’une troisième dimension spatiale, qui permet l’étude des relations spatiales et fonctionnelles des cellules en entier alvéoles et airways11, ainsi que de l’interstitium, système vasculaire et mésothélium. Notamment, PCLS ex vivo modèles sont multicellulaires, ce qui signifie qu’ils contiennent des cellules plus fonctionnelles des poumons in situs, traduisant ainsi étroitement l’environnement biologique indigène lipo et ainsi surmonter les cellules limitées et l’interaction cellule-matrice en 2D plus approches de la culture cellulaire. Jusqu’à présent, ex vivo PCLS murins ont été utilisées pour modéliser des maladies pulmonaires, comme la BPCO12, poumon fibrose13, de cancer du poumon14, infection virale15,16, de dysplasie bronchopulmonaire17, et 18de l’asthme. Toutefois, une proportion considérable de nouvelles pharmacothérapies dans les maladies pulmonaires humaines qui ont été étudiés dans les essais cliniques ne se traduisent pas à la clinique en raison de leur manque d’efficacité ou l’innocuité, assumingly raison de pourtant des différences considérables entre l’homme et murine biologie et maladie19,20,21.
Sur plusieurs années, PCLS humaines ont été utilisés dans une large mesure pour évaluer la toxicité pulmonaire de produits chimiques et de médicaments. Seulement récemment, tissus pulmonaires humains a été utilisée de patients atteints de MPOC22,23, asthme24et poumon fibrose25, pour poursuivre des études physiopathologiques et pharmacologiques. Par à l’aide de matériel organique patients réséqués et générant PCLS, on peut récapituler les caractéristiques principales de la maladie dans un complexe tissu 3D environnement22 représentant et le maintien de la diversité cellulaire native de l’orgue, la plupart. En outre, les tissus malades appliqué dans une variété de configurations expérimentales s’est avéré imiter la maladie comme changements dans le foie, intestin et les reins26,27,28,29.
Traitement du tissu pulmonaire reste cependant difficile pour plusieurs raisons. À la différence des tissus solides, parenchyme pulmonaire natif a tendance à s’effondrer sans ventilation et expositions plus faible rigidité des tissus. Ces propriétés font obstacle à la Coupe du tissu. Ainsi, remplissage des voies respiratoires et de l’espace alvéolaire avec bas point de fusion point d’agarose conserve la structure du poumon natif et fournit la rigidité nécessaire pour trancher le coupe de précision des poumons murins et humains30. Resectates du poumon humain donnés aux fins de la recherche sont par leur nature anatomique, génétiquement et physiologiquement très diversifiée, ce qui souvent présente une grande variabilité inter patiente lors de l’exécution d’expériences25. Contrairement à la lobe entier ou un poumon entier des explants, échantillons de poumon réséqués au moyen de la chirurgie thoracique ne font pas nécessairement suivre les segments anatomiques et requièrent donc une préparation spéciale. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé et optimisé pour la génération d’humains PCLS de tissu réséqué pulmonaire et leur culture ultérieure et l’utilisation expérimentale des maladies pulmonaires modèle.
Le protocole décrit dans ce manuscrit couvre la génération de PCLS de resectates tissu de poumon humain rempli d’agarose liquide et tranchage vibratome ultérieur. Génération de tranches de tissus a été démontrée avant pour un couple des organes, comme le foie et le cerveau, tandis que la rigidité inhérente de ces organes autorisés directe trancher sans aucune modification du tissu. À noter, la bonne préparation initiale du tissu pulmonaire est l’étape plus cruciale dans la génération de CIP. Remplissage de gel d’agarose du poumon est la méthode de choix pour stabiliser sa nature douce et élastique, tout en assurant une génération PCLS homogène et reproductible. Grandes voies aériennes du tissu pulmonaire réséqués sont canulés pour permettre l’accès des petites voies aériennes, ainsi que sur le parenchyme pulmonaire intact. L’absence d’une plèvre intacte, qui rend agarose remplissant presque impossible, est des principales raisons pourquoi les tissus pulmonaires ne sont généralement pas utilisable pour trancher le poumon. Prospectivement, une plèvre synthétique initialement conçu pour effectuer des expériences fonctionnelles sur des échafauds decellularise potentiellement pourrait être appliqué que pour réaliser le remplissage d’agarose réussie des explants qui n’ont pas une plèvre intact31. Résections résultant dans un morceau de tissu de poumon humain avec plèvre intacts sont essentielles pour générer des blocs de tissus pour le tranchage. Tissu réséqué est plus disponible en raison du tissu exempt de tumeur de la résection du cancer que lobes entièrement intactes ou ensemble-poumon des explants de patients ayant subi une transplantation pulmonaire.
Deux systèmes sont généralement utilisés pour produire le CIP : la Krumdieck tissu trancheuse15 et vibratoires microtomes (vibratomes). Trancheuses de tissu génèrent des tranches en passant un bloc de tissu par un navire de métal, qui coupe le PCLS à 90° à la fin de ce navire. Vibratomes générer PCLS en déplaçant une vibrante couteau horizontalement sur un bloc ancré de tissu qui est immergé dans un bain moyen refroidi, ce qui par rapport à la trancheuse Krumdieck exerce moins force de cisaillement sur le tissu. Il en résulte un traitement moins rigoureux du tissu avant une culture. En revanche, la coupe vibratome est plus de temps et consommer des travaux. Dans nos mains, les poinçons de vibratome tranchage activé la production d’un maximum de 100 PCLS ou 500 PCLS en une seule journée, suffisante pour des études plus expérimentales. PCLS peuvent être cultivées de diverses façons : (a) jointe à Trans-Herbert George wells, générant ainsi une interface d’air liquide système (ALI), (b) en culture d’organe dynamique (DOC), ou (c) immergé dans le milieu de culture cellulaire à des conditions de culture cellulaire standard. La culture en détail du CIP a été précédemment décrit22,23,25; Cependant, une norme commune des conditions de culture entre leur utilisation dans divers laboratoires dans le monde entier est toujours porté disparue. En particulier, le temps de culture pourrait être critique : comme dans PCLS murine, une perte des cellules alvéolaires de type positif 2 SFTPC est observée après 144 h, mais pas après 120 h22. En outre, l’activité métabolique semble rester stable murine22 et humaine PCLS25 pendant 120 h.
Il y a quelques limitations techniques pour la génération de CIP : le nombre et la taille de la resectates fluctue au fil du temps ; l’efficacité de l’agarose de remplissage, qui dépend de la présence de plèvre intact dans les tissus obtenus, détermine le succès final de la génération PCLS ; et la destruction des tissus causée par des changements pathologiques dans le tissu pulmonaire (malades) obtenus risquent d’interférer avec la préparation de la CIP. Obstructions des voies aériennes et tissu fibreux, manque d’espace alvéolaire intact entravent avec agarose remplissage et rendant ainsi le tranchage du tissu fibrotique une tâche exigeante. Emphysémateuses tissus comme trouvent dans les maladies comme MPOC ou déficit en alpha-1-anti-trypsine ne pourrait pas supporter la pression d’agarose remplissage et se traduira par rupture des alvéoles et objets architectes. Dans ces cas, l’utilisation de la concentration d’agarose faible, par exemple, 1 % (p/v), peut être utile pour diminuer la pression et la vitesse pendant le remplissage de gel d’agarose. Dans l’ensemble, l’état de la maladie du tissu peut limiter considérablement l’utilisation du tissu pour la génération de la CIP. Tous ces paramètres déterminent la quantité de PCLS qui peut être généré à partir du tissu pulmonaire, et également la quantité de temps nécessaire pour produire le PCLS. Plus loin les limites de CIP sont incohérences entre les tranches de poumon différentes en ce qui concerne le contenu de taille ou d’un tissu, qui exige de nouvelles étapes de normalisation pour les expériences. Pour y remédier, poinçons de biopsie des régions similaires de la même tranche peuvent être générés. Cette procédure est susceptible de réduire la variabilité des tissus et, comme un avantage supplémentaire, augmenter le nombre d’échantillons PCLS qui peut être utilisé pour des expériences.
En conclusion, les cultures de tissus pulmonaires humains de 3D d’agarose rempli PCLS fournissent un modèle humain complex pour l’étude de la physiologie pulmonaire et les maladies. Le protocole fournit une description détaillée de la préparation de PCLS de tissu réséqué pulmonaire et de leur culture et en outre relève les défis en remplissage de gel d’agarose des résections pulmonaires humaines et des moyens de les surmonter.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs sont reconnaissants à Marisa Neumann pour assistance technique d’experts. Tous les tissus pulmonaires ont été gracieusement fournies par le CTD-M Bio-Archive. Ce travail a été soutenu par le centre allemand de subventions de recherche de poumon (DZL), l’Association Helmholtz et CPC Research School.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |