Co-Immunoprécipitation dosage pour l’étude des Interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les Enzymes
Summary
Nous présentons ici un protocole pour co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur-perle d’étudier simultanément la contribution de domaines de protéines spécifiques des récepteurs de la membrane plasmique à la fois de recrutement d’enzyme et de l’activité enzymatique.
Abstract
Associés aux récepteurs enzymes sont les principaux médiateurs d’activation cellulaire. Ces enzymes sont réglementés, au moins en partie, par des interactions physiques avec des queues cytoplasmique des récepteurs. Souvent, les interactions sont dus à des domaines spécifiques de la protéine et aboutir à l’activation des enzymes. Il existe plusieurs méthodes pour étudier les interactions entre protéines. Tandis que co-immunoprécipitation est couramment utilisée pour étudier des domaines qui sont requises pour les interactions protéine-protéine, il ne sont a aucun tests que la contribution de domaines spécifiques à l’activité des enzymes recrutés en même temps le document. Par conséquent, la méthode décrite ici combine co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur la perle pour l’évaluation simultanée des interactions entre les protéines et l’activation enzymatique associée. Ce protocole vise à identifier les domaines qui sont essentiels pour les interactions physiques entre une protéine et enzymatiques et les domaines qui sont obligatoires pour l’activation complète de l’enzyme. On démontre l’importance de ce test, comme certains récepteurs domaines protéiques contribuent à la liaison de l’enzyme de la queue cytoplasmique du récepteur, tandis que d’autres domaines sont nécessaires pour réguler les fonctions de la même enzyme.
Introduction
Récepteurs catalytiques et récepteurs tyrosine kinases sont des protéines transmembranaires dont liaison d’un ligand extracellulaire provoque l’activité enzymatique du côté intracellulaire1. Certains récepteurs possèdent les récepteurs et les fonctions enzymatiques, tandis que d’autres recrutent des enzymes spécifiques tels que les kinases et phosphatases à leur queue cytoplasmique. Recrutement d’une enzyme à queue du récepteur et de l’action subséquente catalytique de l’enzyme sont deux processus distincts qui ne sont pas toujours régis par la même protéine domaines2. Malheureusement, il n’y a pas d’outils spécifiques pour évaluer l’interaction et l’activité enzymatique en même temps. L’essai de co-immunoprécipitation fonctionnelle décrite ici est une méthode utile pour disséquer le recrutement d’une enzyme de la queue d’un récepteur de son activation. Ce test utilise immunoprécipitation des récepteurs marqués par perles recouverts d’anticorps. Par la suite, une analyse d’activité enzymatique et analyse par western blot sur perles sont effectuées. L’objectif général de cette méthode consiste à découvrir quels domaines protéiques sont nécessaires pour les interactions entre les récepteurs et les enzymes (évaluées par analyse par western blot) et quels domaines sont obligatoires pour l’activation complète des enzymes (mesurée par sur-perle dosage de l’activité enzymatique). Il est important de développer des outils pour étudier les fonctions distinctes des enzymes associées aux récepteurs en raison de leur implication dans la pathogenèse des maladies humaines. Par ailleurs, mieux comprendre les mécanismes d’action de ces protéines peut aider à la conception de nouvelles interventions thérapeutiques.
1 mort programmée (PD-1) est un récepteur inhibiteur sur la surface des cellules T et est nécessaire pour limiter les lymphocytes T excessive. Ces dernières années, les anticorps anti-PD-1 ont été impliqués dans le traitement de multiples affections malignes1,2. PD-1 ligature retient de nombreuses fonctions des lymphocytes T, y compris la prolifération, adhérence et la sécrétion de plusieurs cytokines3,4,5. PD-1 est localisée à la synapse immunologique, l’interface entre les lymphocytes T et les présentatrices d’antigène des cellules6, où il approche avec les récepteurs des lymphocytes T (TCR)7. Par la suite, la tyrosine-phosphatase SHP2 [homologie Src 2 (SH2) domaine contenant tyrosine-phosphatase 2] est recruté à la queue cytoplasmique de PD-1, conduisant à la déphosphorylation des résidus tyrosine clé au sein du complex TCR et ses associés proximales signalisation des molécules3,4,5,8,9. La queue cytoplasmique de PD-1 contient deux motifs de tyrosine, un motif inhibiteur d’immunoreceptor tyrosine-basé (ITIM) et un immunoreceptor tyrosine motif basé-commutateur (ITSM)10. Les deux motifs sont phosphorylées après ligature de PD-19,10. Études de mutagenèse ont révélé un rôle primordial pour la GSTI SHP2 recrutement, par opposition à l’ITIM, dont le rôle dans la signalisation PD-1 et la fonction n’est pas clair4.
Shp2 adopte soit une fermée (plié), inhibe la conformation ou un ouvert (étendu), conformation active11. La contribution de chaque domaine de queue de PD-1 à SHP2 liaison ou l’activation n’a pas encore été élucidée. Pour répondre à cette question, nous avons développé un test qui permet l’essai parallèle du recrutement de SHP2 à la queue de PD-1 et son activité12. Nous avons utilisé co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité de sur-bead phosphatase pour tester l’interaction et l’activité enzymatique en parallèle. À l’aide de ce test, nous montrons que l’ITSM de PD-1 est suffisant pour recruter SHP2 à la queue de PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 est nécessaire pour pleinement s’étendent et activer l’enzyme.
Il n’y a de nombreux récepteurs disposant de plusieurs domaines adjacents dans leurs queues cytoplasmique. Le test fonctionnel co-immunoprécipitation peut découvrir le rôle des domaines spécifiques qui sont nécessaires pour le recrutement de protéines ou activation enzymatique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des interactions de récepteur-enzyme sont cruciales pour la signalisation intracellulaire. De nombreuses enzymes sont recrutés aux récepteurs à travers les domaines SH2 liant à des tyrosines phosphorylés qui décorent les queues des mêmes récepteurs. Cependant, enzymes sont souvent pliés en conformations inactives fermées, et l’activation requiert un changement conformationnel de11 qui peut être médiée par les autres domaines d’un même récepteur. Le test décrit ici mesures les …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le NIH subventions 1R01AI125640-01 et la rhumatologie Research Foundation.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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