Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle Assay, den Beitrag der spezifischen Proteins Domänen der Plasmamembran Rezeptoren Enzym Rekrutierung und Enzym-Aktivität gleichzeitig zu studieren.
Abstract
Rezeptor-assoziierten Enzyme sind die wichtigsten Vermittler der zellulären Aktivierung. Diese Enzyme sind mindestens im Teil, durch die physikalischen Wechselwirkungen mit zytoplasmatischen Schwänzen der Rezeptoren geregelt. Die Interaktionen oft durch spezifisches Protein Domänen auftreten und Aktivierung der Enzyme führen. Es gibt mehrere Methoden, um Interaktionen zwischen Proteinen zu untersuchen. Während co-Immunopräzipitation häufig verwendet, um Domänen zu studieren, die für Protein-Protein-Wechselwirkungen erforderlich sind, gibt es keine Tests dieses Dokument den Beitrag von bestimmten Domänen zur Aktivität der rekrutierten Enzyme zur gleichen Zeit. Die hier beschriebene Methode kombiniert dementsprechend co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle-Assay für simultane Auswertung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und damit verbundenen enzymatische Aktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist, die Domains zu identifizieren, die sind entscheidend für die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Protein und Enzym und Domänen, die für die vollständige Aktivierung des Enzyms obligatorisch sind. Die Bedeutung des Assays gezeigt, als bestimmten Rezeptor Protein Domänen dazu beitragen, die Bindung des Enzyms der cytoplasmatischen Schwanz des Rezeptors, während andere Bereiche sind notwendig, um die Funktion des gleichen Enzyms zu regulieren.
Introduction
Katalytische Rezeptoren und Rezeptor-Tyrosin-Kinasen sind transmembrane Proteine in die Bindung eines extrazellulären Liganden enzymatische Aktivität auf die intrazelluläre Seite1verursacht. Einige Rezeptoren besitzen Rezeptor und enzymatische Funktionen, während andere spezifische Enzyme wie Kinasen und Phosphatasen zu ihre cytoplasmatischen Tails zu rekrutieren. Rekrutierung eines Enzyms an den Rezeptor Tail und die anschließende katalytische Wirkung dieses Enzyms sind zwei separate Prozesse, die nicht immer von der gleichen Protein Domänen2geregelt sind. Leider gibt es keine spezifische Werkzeuge, um das Zusammenspiel und die enzymatische Aktivität gleichzeitig zu beurteilen. Hier beschriebenen funktionellen co-Immunopräzipitation-Assay ist eine nützliche Methode, um die Rekrutierung eines Enzyms am Schwanz eines Rezeptors aus seiner Aktivierung zu sezieren. Dieser Assay nutzt Immunopräzipitation tagged Rezeptoren durch Antikörper-beschichtete Perlen. Anschließend erfolgt eine enzymatische Aktivität Assay und western-Blot-Analyse auf Perlen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist zu entdecken, welche Protein-Domains für Interaktionen zwischen Rezeptoren und Enzymen (bewertet von western-Blot Analyse) notwendig sind und welche Domains sind verbindlich für die vollständige Aktivierung der Enzyme (gemessen am Wulst enzymatische Aktivität Assay). Es ist bezeichnend, Werkzeuge für das Studium der getrennten Funktionen der Rezeptor-assoziierten Enzyme aufgrund ihrer Beteiligung an der Pathogenese von Krankheiten des Menschen zu entwickeln. Weitere Verständnis der Wirkmechanismen dieser Proteine kann darüber hinaus die Gestaltung der neue therapeutische Interventionen helfen.
Programmierten Tod-1 (PD-1) ist eine inhibitorische Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen und ist erforderlich für die Begrenzung der übermäßige T-Zell-Reaktionen. In den letzten Jahren haben Anti-PD-1 Antikörper bei der Behandlung von mehreren Malignome1,2verwickelt. PD-1 Ligatur hemmt zahlreiche T-Zell-Funktionen, einschließlich der Proliferation, Haftung und Sekretion von mehrere Zytokine3,4,5. PD-1 ist auf der immunologischen Synapse, die Schnittstelle zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen6, lokalisiert, wo es mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR)7colocalizes. Anschließend die Tyrosin-Phosphatase SHP2 [Src Homologie 2 (SH2) Domäne mit Tyrosin Phosphatase 2] wird der cytoplasmatischen Schwanz des PD-1, führt zu wichtigen Tyrosin Rückstände innerhalb der TCR komplex und die damit verbundenen proximalen dephosphorylation rekrutiert Signalisierung Moleküle3,4,5,8,9. Die zytoplasmatischen Schweif von PD-1 enthält zwei Tyrosin Motive, ein Immunoreceptor Tyrosin-basierte hemmenden Motiv (ITIM) und eine Immunoreceptor Tyrosin basierend-Schalter Motiv (ITSM)10. Beide Motive sind auf PD-1 Ligatur9,10phosphoryliert. Mutagenese Studien ergaben eine primäre Rolle für die ITSM im SHP2 Einstellung, im Gegensatz zu den ITIM, deren Rolle in der PD-1 Signal- und Funktion nicht klar ist4.
SHP2 nimmt entweder eine geschlossene (gefaltet), Konformation oder eine offene (verlängert), aktive Konformation11gehemmt. Der Beitrag der jeweiligen Tail-Domäne von PD-1 SHP2 Bindung oder Aktivierung ist noch nicht aufgeklärt. Um diese Frage zu beantworten, haben wir eine Probe, die es ermöglicht parallele Prüfung der Einstellung von SHP2 am Schwanz des PD-1 und seine Aktivität12entwickelt. Wir Beschäftigten co-Immunopräzipitation und eine auf Perle Phosphatase Aktivität Assay, das Zusammenspiel und die Enzymaktivität parallel zu testen. Mit Hilfe dieser Assay, zeigen wir, dass die ITSM PD-1 ausreichend ist, um SHP2 am Schwanz des PD-1, während die ITIM PD-1 erforderlich ist, um vollständig zu erweitern und aktivieren das Enzym zu rekrutieren.
Es gibt viele Rezeptoren, die einige angrenzende Gebiete in den zytoplasmatischen Schwänzen haben. Die funktionale co-Immunopräzipitation-Assay kann die Rolle von bestimmten Domänen aufzudecken, die für Protein Rekrutierung oder enzymatische Aktivierung notwendig sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rezeptor-Enzym Interaktionen sind entscheidend für die intrazelluläre Signalisierung. Viele Enzyme werden rekrutiert, an Rezeptoren durch SH2-Domänen binden an phosphorylierten Tyrosines, die Enden von den gleichen Rezeptoren zu schmücken. Jedoch Enzyme sind oft in geschlossenen inaktive Konformationen gefaltet und Aktivierung erfordert eine Konformationsänderung11 , die von anderen Domänen die gleichen Rezeptor vermittelt werden können. Der Test beschriebenen hier Maßnahmen, die die Wechs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien 1R01AI125640-01 und der Rheumatologie Research Foundation finanziert.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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