음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화
Summary
혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.
Abstract
이 메서드는 trypanosomes, 기생충 감염 된 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리 수 있습니다. 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며 또한이 기생충 정화 방법 serological 허가 하 고 조사 연구.
모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 에 의해 발생 및 T. b. rhodesiense. 관련된 trypanosomes는 동물 trypanosomiasis의 원인이 되는 에이전트. Trypanosome 탐지 모자 진단, 치료 및 후속 필수적 이다. 여기에 설명 된 기술은 가장 중요 한 기생충 검출 기법, T. b. gambiense 모자의 진단에 대 한 필드 조건에 적응 이며, 1 시간 이내 완료 될 수 있다. 혈액은 pH 8, 이전 조정 하는 음이온 교환기 열 (DEAE 셀 룰 로스)에 층이 고 차입 버퍼 추가 됩니다. 덜 부정 청구 trypanosomes 통과 하는 반면 매우 부정적으로 위탁 된 혈액 세포는 열에 흡착 됩니다. 수집 된 trypanosomes 원심 분리에 의해 수송과 있으며 현미경으로 관찰. 또한, 기생충은 그들의 infectivity 유지 하는 동안 세포 손상 없이 준비 됩니다.
순화 trypanosomes는 필요한 면역 테스트; 그들은 trypanolysis 분석 결과, 모자 혈 청 학에 골드 표준에에서 사용 됩니다. 얼룩진된 기생충 필드 혈 청 학에 대 한 카드 교착 시험 (CATT)에 활용 됩니다. 항 원은 변형 표면 당단백질, exoantigens, 같은 순화 trypanosomes에서 다양 한 immunoassays에도 사용 됩니다. 여기에 설명 된 절차는 아프리카 trypanosomes;에 대 한 설계 되었습니다. 따라서, 크로마토그래피 조건 호스트 포유동물의 각 종족의 피를 각 trypanosome 스트레인, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다.
병원 체를 매혹적인 이들은 쉽게 순화 하 고 사용 수 생화학, 분자 세포 생물학 연구 호스트 세포 막 수용 체, 신호 전달, 유전자의 수준에서 호스트 기생충 관계 조사와 공동 문화를 포함 하 여 식; 약물 테스트 시험관; 유전자 삭제, 돌연변이, 또는 신진 대사 과정, cytoskeletal 속 기생충 생존에 overexpression의 조사.
Introduction
제시 하는 방법을 설명 여기 trypanosomes, 기생충 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리를 수 있습니다. 이 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며이 기생충 정화 방법 강력한 serological 및 연구 조사를 허용 하는 또한.
모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 와 T. b. rhodesiense1. 발생 이 protozoan 기생충 질병 (hemolymphatic 단계)의 첫 번째 단계에서 혈 류, 림프, 및 간 질 성 체액 extracellularly 곱하면 됩니다. 2 단계 (meningoencephalitic stage) 시작 때 기생충 혈액 뇌 장벽; 신경 징후,이 질병에 그것의 이름을 “잠자는 병” 주신, 수 면 장애를 포함 하 여이 2 단계2의 전형입니다. 관련된 trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei)는 동물 아프리카 trypanosomosis (AAT)3의 원인이 되는 에이전트.
세계 보건 기구 (WHO) 2020 공중 보건 문제로 모자를 제거 하 고 20304전송 중지를 목표로 합니다. 급속 한 진단 테스트의 최근 소개는 향상 된 혈 청 학적인 진단1,,45. 여러 가지 분자 진단 테스트 개발 되었습니다 하지만 필드 진단에 그들의 역할은 아직 되지 설립된5. 그들은 brucei 그룹 및 기생충 동물 trypanosomosis6에 대 한 책임에 의해 발생 하는 비정형 trypanosomiasis의 하위 종류를 식별 하는 데 사용 됩니다.
혈 청 학 틀린 긍정적이 고 불행 하 게도 틀린 부정적인 결과1을 줄 수 있는 기생충의 검출 진단, 치료 및 후속, 필수적 이다. 이러한 hemoflagellate 원생의 직접적인 현미경 관찰 모자 경우 발생 하는 T. b. gambiense, (케이스의 95% 이상)에 의해 낮은 parasitemias는 규칙으로 모자에 대 한 T. b. rhodesiense, 큰에 의해 발생 하는 반면에 어렵습니다. 기생충의 수는 자주 혈액에 존재 한다. 다양 한 농도 기술은 사용 된 두꺼운 드롭 등 세관 원심 분리 (CTC), 하지만 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스)의 열에 의해 혈액에서 기생충의 분리 다음 원심 분리와 현미경 관찰은 작은, 가장 민감한 방법 (혈액의 약 50 기생충/mL를 검출 될 수 있다)1,7. 따라서,이 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스) 메서드에서 trypanosomes의 정화는 최고 고, 데이트, 시각화 및 격리 모자 진단 위한 혈액에서 기생충에 대 한 참조 방법. 필드 조건에서 DEAE 룰의 미니 열 성공적으로 사용 되 고 현미경 관찰7,8을 촉진 하는 몇 가지 개선.
혈액, 아래 설명에서 trypanosome 분리의 방법은 포유류 혈액 세포9보다 덜 부정적 이다 기생충 표면 충전에 따라 다릅니다. 흥미롭게도,이 방법은 50 년 전, 박사 쉴라 란 햄에 의해 1968 년에 개발 되었다 고 검색 및 혈 류 trypanosomes의 준비에 대 한 황금 표준 남아. 그것은 빠르고 다양 한 포유류, 허용 하는 둘 다 인간과 동물 trypanosomiasis10의 진단에서에서 salivarian trypanosomes에 대 한 재현.
생활, 정화 기생충, 감염 된 혈액은 음이온 교환기 열에 추가 됩니다. 크로마토그래피 조건 (주로 pH, 이온 강도 버퍼/미디어의) 포유류 혈액 세포와 trypanosomes10각 믹스를 각 trypanosome 종, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다. 차입 버퍼 pH 8 대부분의 아프리카 trypanosomes10정확 하 게 조정 됩니다. Parasitemias 너무 낮은 혼자, 현미경 관찰에 의해 검출 될 수 있기 때문에이 방법은 환자의 혈액에서 발견 하는 기생충의 농도 호의 하 고 실험실 조사 수 있습니다. 일 갓 격리 된 trypanosomes와이 기술을 사용 하 여 감염 된 동물의 혈액에 무기한 기간에 대 한 실험실에 있는 axenic 조건에서 배양 된 기생충으로 연구 보다는 다양 한 조사에 대 한 관련입니다.
호스트 기생충 관계는 기생충 감염, 따라서, 그것의 자연적인 호스트 T. musculi, 자연 murine 기생충, 세포 외 trypanosomes의 대표, murine 감염에 관련 된 많은 이점이 가장 공부를 작은 실험실 동물 생물 안전 수준 (BSL) 조건 필요 하지 않습니다. T. musculi 인간 병원 체를 포함 하 여 다른 많은 Trypanosoma 종 달리 immunocompetent 쥐 죽 일 하지 않습니다. T. musculi 는 T 세포를 박탈 쥐에서 제거 되지 하 고 parasitemias 식품 및 영양소 섭취 량11를 수정 하 여 감염 된 생쥐에서 증가할 수 있다. 이 기생충에는 다른 병원 체12co 감염에 면역 반응 조절 한다. T. musculi 교양된 T. musculi 에서 감염 된 쥐 전시 차이에서 예를 들어 막 Fc 수용 체의 식 T. musculi axenic 문화, 기생충 감염된 쥐13 에서 정화에 비해 손실 됩니다. , 14. Excreted 분 비 요소 (ESF) 또한 질적 및 양적 덜 axenic trypanosome 문화 표현 되며 발병 지역15에 고립 된 긴장 사이 다. ESF는 호스트 면역 시스템에 표시 되 고 그래서 플레이 초기 호스트에서 중요 한 역할 면역 응답16를 첫 번째 항.
실험적 감염 동물 실험실 조사,이 프로토콜 마우스 immunosuppressed 동물을 사용할 때에 특히 필요한 수를 최소화 하는 기생충의 더 많은 수에 용이. 변형 표면 glycoproteins (VSGs)에 사용 되는 카드 교착 테스트 Trypanosomiasis (CATT)에 대 한 대량 검사에는 여전히 쥐에서 전파 되는 trypanosomes에서 순화 된다. 2 급속 한 진단 테스트 (개별적으로 감싸인된 카세트)는 필드에서 사용 하기 위해 사용할 수 있는 네이티브 VSGs와 trypanosomes에 체 외에서 배양 하지1,4, 의 감염 모델 소스를 사용 하 아직도 5. 이후 자연스럽 게 또는 실험적으로 감염 된 호스트에서 대량 및 특히, 설치류 DEAE 룰 정화 기생충이 쉽게 얻을 수 있습니다 trypanosome 면역학 및 생물학의 연구에서 발전 촉진 되었습니다 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
순화 trypanosomes 면역학, 생화학, 세포 및 분자 생물학을 공부 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 데이터 및 결과의 큰 확대는 다음 도움이 되는 정보를 얻기 위해 다른 진 핵 세포30trypanosomes에서 얻은 되어 있다. Trypanosomes는 또한 중요 하 고 흥미로운 연구 주제 때문에 그들은 생존 하 고 두 개의 매우 다른 환경에서 성장 하는 그들을 허용 하는 수많은 기계 장치를 고안 했다: 체체파?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD 대학교 드 보르도의 모든 회원을 감사합니다. 이 연구는 보르도의 대학에서 내부 자금에 의해 지원 되었다 및 지원 LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ANR 및 협회에서 부 르 지속 가능성 드 라 검색 en parasitologie 외 두개골 트로피와 서비스 드 coopération 동부 표준시 d’action culturelle de l’Ambassade de 프랑스 à 방기 (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
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