Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Il metodo presentato descritto qui consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), dal sangue. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi robusto indagine sierologica e di ricerca.

CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.¹. Questi protozoi parassiti si moltiplicano extracellularly nella circolazione sanguigna, linfatica e fluidi interstiziali durante la prima fase della malattia (stadio emolinfatico). La seconda fase (fase meningoencephalitic) inizia quando i parassiti attraversano la barriera ematoencefalica; segni neurologici, tra cui un disturbo del sonno, che ha dato il suo nome “malattia del sonno” per questa malattia, sono tipici di questa seconda fase². Trypanosomes correlate (T. evansi, T. congolense, vivax T. brucei b. T.) sono gli agenti causali di animale africano Tripanosoma (AAT)³.

L’organizzazione mondiale della sanità (OMS) mira all’eliminazione cappello come un problema di salute pubblica entro il 2020 e di fermare la trasmissione di 2030⁴. La recente introduzione di test di diagnosi rapida ha una migliore diagnosi sierologica^1,4,5. Diversi test diagnostici molecolari sono stati sviluppati ma il loro ruolo nella diagnostica sul campo non è stato ancora stabilito⁵. Essi vengono utilizzati per identificare la sub-specie del gruppo brucei e tripanosomiasi atipica causata da parassiti responsabili di animale Tripanosoma⁶.

La rilevazione del parassita è essenziale per la diagnosi, trattamento e follow-up, come la sierologia può dare risultati falsi positivi e purtroppo falsi negativi¹. L’osservazione microscopica diretta di questi protisti emoflagellato è difficile nei casi di cappello che sono causati da gambiense del t.b., (più di 95% dei casi) come bassi parassitemie sono la regola, mentre per il cappello causato da rhodesiense del t.b., un grande numero di parassiti sono spesso presente nel sangue. Sono state utilizzate varie tecniche di concentrazione, come goccia spessa e centrifugazione tubo capillare (CTC), ma la separazione dei parassiti dal sangue di una colonna di scambiatore di anioni (DEAE cellulosa) seguita da centrifugazione e osservazione al microscopio della a pellet, è il metodo più sensibile (può essere rilevato circa 50 parassiti/mL di sangue)^1,7. Di conseguenza, la purificazione di trypanosomes da questo metodo di anione-scambiatori (DEAE cellulosa) è il migliore e, ad oggi, il metodo di riferimento per la visualizzazione e isolare i parassiti dal sangue per la diagnosi di cappello. In condizioni di campo, una mini-colonna di DEAE cellulosa è stata utilizzata con successo e diversi miglioramenti hanno facilitato l’osservazione microscopica^7,8.

Il metodo di separazione Tripanosoma dal sangue, descritto di seguito, dipende dalla carica superficiale del parassita, che è meno negativo di cellule del sangue dei mammiferi⁹. Interessante, questo metodo è stato sviluppato 50 anni fa, nel 1968 da Dr. Sheila Lanham e rimane il gold standard per il rilevamento e la preparazione dei tripanosomi flusso sanguigno. È veloce e riproducibile per salivarian trypanosomes da una vasta gamma di mammiferi, permettendo la diagnosi di entrambi di tripanosomiasi animale e umano¹⁰.

Per ottenere parassiti living, purificati, sangue infetto è aggiunto su una colonna di scambiatore di anioni. Condizioni di cromatografia (principalmente pH, forza ionica del buffer e media) devono essere adattati ad ogni specie di Tripanosoma e più in generale, ad ogni mix di cellule del sangue dei mammiferi e trypanosomes¹⁰. Tampone di eluizione è regolato precisamente a pH 8 per l’africano trypanosomes¹⁰. Questo metodo favorisce la concentrazione di parassiti trovati nel sangue dei pazienti, perché parassitemie può essere troppo bassa per essere rilevata da osservazione microscopica da solo, e permette anche le indagini del laboratorio. Lavorare con trypanosomes appena isolate e il sangue di animali infetti, utilizzando questa tecnica, è più pertinente per varie indagini rispetto agli studi con i parassiti che sono stati coltivati in condizioni axeniche in laboratorio per un periodo indefinito.

Rapporti ospite-parassita sono meglio studiati con un parassita che infetta il sua ospite naturale, pertanto, musculi T., un parassita murino naturale, che è rappresentante di trypanosomes extracellulare, ha molti vantaggi come infezione murina coinvolge un piccolo laboratorio animale e non necessita di condizioni di livello (BSL) di sicurezza biohazard. T. musculi non uccidere i topi immunocompetenti, a differenza di molte altre specie di Trypanosoma , tra cui agenti patogeni umani. T. musculi non vengono eliminate in topi privati del T cell e parassitemie può essere aumentato in topi infettati modificando l’assunzione degli elementi nutritivi e cibo¹¹. Questo parassita modula la risposta immunitaria in co-infezioni con altri agenti patogeni¹². T. musculi da topi infetti esibire differenze da coltivate musculi T., ad esempio, l’espressione di recettori di membrana Fc viene perso in T. musculi colture axeniche, rispetto ai parassiti purificati da topi infetti^{13 , 14}. fattori secreti Excreted (FSE) sono anche qualitativamente e quantitativamente meno espressa nelle colture axeniche Tripanosoma e differiscono tra i ceppi isolati in zone endemiche¹⁵. FSE sono gli antigeni primi da visualizzare per il sistema immunitario dell’ospite e quindi giocare un ruolo importante nell’host iniziale risposta immunitaria¹⁶.

Negli animali infettati sperimentalmente per le indagini del laboratorio, questo protocollo facilita la sperimentazione su un maggior numero di parassiti, riducendo al minimo il numero di topi necessaria soprattutto quando si utilizzano animali immunodepressi. Le glicoproteine di superficie variante (generatori di segnale vettoriale) che vengono utilizzate nel Test di agglutinazione di carta per tripanosomiasi (CATT) in screening di massa sono ancora purificate da trypanosomes che vengono propagati in ratti. I due test diagnostici rapidi (confezionati singolarmente cassette) che sono ora disponibili per l’uso in campo, ancora utilizza un’origine infettiva modello nativo generatori di segnale vettoriale e non in vitro coltivate trypanosomes^{1,4, 5}. l’avanzamento nello studio del Tripanosoma immunologia e biologia è stata facilitata dal momento che questi parassiti DEAE cellulosa purificata possono essere facilmente ottenuti in grandi quantità dai padroni di casa naturalmente o sperimentalmente infetti e in particolare, roditori.