Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

De methode voorgesteld beschreven hier kunnen de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), uit bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode vergunningen robuuste serologische en onderzoek onderzoek.

HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense¹. Deze eencellige parasieten vermenigvuldigen extracellularly in de bloedsomloop, lymfe en interstitiële vocht tijdens de eerste fase van de ziekte (hemolymphatic fase). De tweede fase (meningoencephalitic fase) begint als parasieten over de bloed-hersenbarrière; neurologische symptomen, met inbegrip van een wanorde van de slaap, die haar naam “slaapziekte” aan deze ziekte heeft gegeven, zijn typerend voor deze tweede fase². Verwante trypanosomen (T. b. brucei, T. vivax, T. congolense, T. evansi) zijn de causatieve agenten van dier Afrikaanse trypanosomosis (AAT)³.

De World Health Organization (WHO) wil elimineren hoed als een probleem voor de volksgezondheid in 2020 en stoppen van de transmissie door 2030⁴. De recente invoering van snelle diagnose tests heeft verbeterde serologische diagnose^1,4,5. Verschillende moleculair diagnostische tests zijn ontwikkeld, maar hun rol in de diagnostische gegevens van het veld nog niet is vastgesteld⁵. Ze worden gebruikt voor het identificeren van de sub-soorten van de brucei groep en atypische trypanosomiase veroorzaakt door parasieten die verantwoordelijk zijn voor dierlijke trypanosomosis⁶.

De detectie van de parasiet is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up, zoals serologie kan valse positieve en helaas valse negatieve resultaten¹geven. De directe microscopische observatie van de protisten van deze hemoflagellate is moeilijk in HAT gevallen die worden veroorzaakt door t.b. gambiense, (meer dan 95% van de gevallen) als lage parasitemias de regel zijn, terwijl voor hoed veroorzaakt door t.b. rhodesiense, een grote aantal parasieten zijn vaak aanwezig in het bloed. Verschillende concentratie technieken zijn gebruikt, zoals de daling van de dikke en capillair centrifugeren (CTC), maar de scheiding van parasieten van bloed door een kolom van anionenwisselaar (cellulose Gebondenkleurstof) gevolgd door centrifugatie en microscopische observatie van de pellet, is de meest gevoelige methode (ongeveer 50 parasieten/mL bloed kunnen worden gedetecteerd)^1,7. Bijgevolg, de zuivering van trypanosomen door deze methode anion-wisselaars (cellulose Gebondenkleurstof) is de beste en, tot op heden, de referentiemethode voor het visualiseren en isoleren van parasieten uit bloed voor hoed diagnose. In veldomstandigheden, een mini kolom van cellulose Gebondenkleurstof is succesvol gebruikt en verschillende verbeteringen hebben vergemakkelijkt microscopische observatie^7,8.

De methode van trypanosoom scheiding van bloed, hieronder beschreven, hangt af van parasiet oppervlakte heffing, welke minder negatief dan bloed zoogdiercellen⁹is. Interessant is dat deze methode 50 jaar geleden, in 1968 door Dr. Sheila Lanham werd ontwikkeld, en blijft de gouden standaard voor detectie en voorbereiding van de bloedbaan trypanosomen. Het is snel en reproduceerbare voor salivaria trypanosomen uit een breed scala van zoogdieren, de diagnose van zowel mens en dier van trypanosomiasis¹⁰het toelaat.

Met het oog op een levend, gezuiverde parasieten, wordt geïnfecteerd bloed op een anionenwisselaar kolom toegevoegd. Chromatografie voorwaarden (voornamelijk pH, Ionische sterkte van buffers/media) hebben elk trypanosoom soorten, en meer in het algemeen, worden aangepast aan elke mix van zoogdieren bloed cellen en de trypanosomen¹⁰. Elutie buffer wordt juist ingesteld op pH 8 voor de meeste Afrikaanse trypanosomen¹⁰. Deze methode geeft voorrang aan de concentratie van parasieten gevonden in het bloed van patiënten, omdat parasitemias kan te laag worden gedetecteerd door microscopische observatie alleen, en hierdoor ook laboratoriumonderzoek. Werken met vers geïsoleerde trypanosomen en op het bloed van besmette dieren, met behulp van deze techniek, is meer relevant voor verschillende onderzoeken dan studies met parasieten die in een van de omstandigheden in het laboratorium hebben zijn gekweekt voor onbepaalde tijd.

Gastheer-parasiet-relaties worden best bestudeerd met een parasiet infecteren de natuurlijke gastheer, daarom, T. musculi, een natuurlijke lymfkliertest parasiet, die representatief is voor de extracellulaire trypanosomen, heeft vele voordelen zoals lymfkliertest infectie gaat in een kleine proefdier en vereist geen biohazard veiligheidsvoorwaarden niveau (BSL). T. musculi doodt niet immunocompetent muizen, in tegenstelling tot vele andere soorten van Trypanosoma , waaronder de menselijke pathogenen. T. musculi zijn in T-cel-beroofd muizen niet geëlimineerd en parasitemias bij besmette muizen kan worden verhoogd door het wijzigen van voedsel en voedingsstoffen inname¹¹. Deze parasiet moduleert de immuunrespons bij co-infecties met andere ziekteverwekkers¹². T. musculi van geïnfecteerde muizen vertonen verschillen van gekweekte T. musculi, bijvoorbeeld de uitdrukking van membraan Fc receptoren is verloren gegaan in T. musculi Axenische culturen, in vergelijking met parasieten gezuiverd van geïnfecteerde muizen^{13 , 14}. Excreted-uitgescheiden factoren (ESF) zijn ook kwalitatief en kwantitatief minder uitgesproken in een trypanosoom culturen en verschillen tussen stammen geïsoleerd in endemische gebieden¹⁵. ESF zijn de eerste antigenen om te worden weergegeven om het immuunsysteem van de gastheer en dus spelen een belangrijke rol in de oorspronkelijke host immuunrespons¹⁶.

In experimenteel geïnfecteerde dieren voor laboratoriumonderzoek vergemakkelijkt dit protocol experimenten met een groter aantal parasieten, minimaliseren van het aantal muizen vereist vooral bij gebruik van immunosuppressie dieren. De variant oppervlakte glycoproteïnen (VSGs) die worden gebruikt in de Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) in mass screening zijn nog gezuiverd van trypanosomen die worden doorgegeven bij ratten. De twee snelle diagnostische tests (individueel verpakt cassettes) die nu beschikbaar zijn voor gebruik in het veld zijn nog steeds met een besmettelijk model bron van inheemse VSGs en niet in vitro gekweekt trypanosomen^{1,4, 5}. de vooruitgang in de studie van de trypanosoom immunologie en celbiologie heeft bevorderd aangezien deze parasieten van de gezuiverde cellulose Gebondenkleurstof gemakkelijk worden in grote hoeveelheden van nature of experimenteel geïnfecteerde hosts, en met name knaagdieren verkregen kunnen.