Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

Cellule di mammifero sono soggetti a sollecitazioni meccaniche, osmotico e biochimici, causando la perdita di integrità della membrana del plasma. Senza una chiusura rapida ed efficiente, le cellule danneggiate sarebbero rapidamente soccombere alla morte programmata o necrotica. Dal 1960, sforzi per comprendere la membrana di plasma una chiusura processo sono stati motivati dalle conseguenze devastanti connesse con sue disfunzioni. Infatti, malattie come la distrofia muscolare dei cingoli, il diabete e la sindrome di Chediak-Higashi sono state collegate alla riparazione della membrana di plasma carente a causa di mutazioni nel gene codifica disferlina, produzione di prodotti finiti avanzati di glycation e difetti di il regolatore di traffico lisosomiale CHS1, rispettivamente^1,2,3,4,5,6. Tuttavia, ad oggi, la nostra comprensione della membrana una chiusura è ancora limitata⁷. Gli studi iniziali hanno dimostrato che la chiusura della membrana viene avviata dall’afflusso di extracellulare Ca^{2 +} attraverso la membrana plasmatica danneggiata^8,9,10. Da allora, parecchi non escludono Ca^{2 +}-dipendente meccanismi sono stati proposti per sigillare le cellule. L’ipotesi di patch propone che in vicinanza alla ferita, vescicole intracellulari fusibile con l’altro e la membrana plasmatica danneggiata di agire come un patch^11,12,13,14. Un secondo modello propone che l’esocitosi calcio-dipendente dei lisosomi la ferita sito rilascia la sfingomielinasi acida lysosomal degli enzimi, che converte la sfingomielina alla ceramide l’opuscolo esterno della membrana plasmatica. Questo improvviso cambiamento nella composizione lipidica si traduce in ceramide-driven endocitosi del regione danneggiata^15,16,17. Infine, il terzo meccanismo proposto prevede un ruolo per il endosomal ordinamento complessi necessari per il trasporto (ESCRT) promuovere la formazione di vescicole di rivolte che bud fuori dalla membrana plasmatica¹⁸. Solo un set limitato di proteine è stato identificato in questi modelli, e loro macchinari devono essere ulteriormente chiarito.

Qui descriviamo un saggio di alto-rendimento che misure sulla membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero aderente sottoposto a danni mediati da ricombinante Listeriolisina O (LLO)¹⁹. LLO è una tossina che formano dei pori (PFT) secernuta dall’agente patogeno intracellulare facoltativo Listeria monocytogenes^20,21,22 ed appartiene al MACPF/CDC (complesso di attacco della membrana, perforina, e Superfamiglia Citolisina colesterolo-dipendente). MACPF sono mammiferi poro-formare proteine coinvolte nelle difese immunitarie, mentre CDCs sono tossine batteriche principalmente prodotte da patogeni Gram-positivi che danneggiano le cellule dell’ospite per promuovere i loro stili di vita patogeni²³. CDCs sono sintetizzati come monomeri solubili in acqua o dimeri che si legano al colesterolo presentano nella membrana plasmatica e oligomerizzazione in un complesso prepore di fino a 50 unità secondarie. Il complesso prepore quindi riorganizza per inserire β-fili attraverso il doppio strato lipidico, formando un poro del β-barilotto che si estende su 30-50 nm in diametro^24,25,26,27.  Questi grandi pori consentono flussi di ioni e piccole componenti cellulari dentro e fuori la cellula; però, alcuni studi hanno proposto che i pori di dimensioni più piccole sono anche formato^28,29,30. Tra il CDCs, LLO Visualizza proprietà uniche, tra cui l’aggregazione irreversibile e temperatura-dipendente dal pH, che è favorevole alla analisi di alto-rendimento^31,32. LLO possa essere aggiunti al terreno di coltura cellulare a 4 ˚ c, una temperatura permissiva al suo legame alle cellule, ma non per la formazione del poro complessa. L’inizio della formazione dei pori può essere sincronizzato quindi alzando la temperatura a 37 ° c, consentendo la diffusione efficiente delle molecole di tossina nel piano della membrana per formare oligomeri e per il rimodellamento conformazionali coinvolti nella generazione del poro. Pertanto, seguendo l’interruttore della temperatura, la cinetica di danno delle cellule dipenderà la quantità di tossina associata alla membrana plasmatica. D’importanza, LLO solubile (non legato alla membrana plasmatica) rapidamente e irreversibilmente aggrega al raggiungimento della temperatura di 37 ° c, che riduce la necessità di lavare via molecole di tossina non associato e limita l’entità del danno di membrana nel corso del tempo. Infine, perché LLO lega al colesterolo e forma i pori nelle membrane ricchi di colesterolo, questo test è suscettibile di una vasta gamma di cellule di mammifero. È importante tenere a mente che LLO colpisce la cellula ospite segnalazione principalmente attraverso la formazione dei pori, con poche eccezioni in quale cella di poro-indipendente di segnalazione può verificarsi^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Pertanto, non può essere escluso che LLO segnalazione attività possono influenzare il processo di riparazione della membrana.

Questo test valuta direttamente la portata della cella ferendo misurando l’incorporazione di un fluorocromo impermeant cella (ad es., ioduro di propidio) che entra nelle cellule ferite e diventa altamente fluorescente, una volta che si associa con acidi nucleici passivamente . Quindi, il fluorocromo possa essere mantenuto in medium della coltura cellulare in tutto l’esperimento, permettendo analisi in tempo reale della cella ferendo. L’intensità di fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione aumenterà con la concentrazione della tossina e, per una data concentrazione della tossina, aumenterà nel tempo fino a quando non si formano tutti i pori, e le cellule sono completamente riparate o finché non viene raggiunto la saturazione. L’afflusso di extracellulare Ca^{2 +} attraverso i pori della membrana è un evento di conditio sine qua non per una chiusura. Di conseguenza, l’efficienza risigillazione può essere indirettamente evidenziato confrontando cella ferendo in terreno di coltura contenente Ca^{2 +} (riparazione condizione permissiva) al ferimento in Ca^{2 +}-mezzo libero (condizione restrittiva di riparazione). Poiché l’intensità della fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione è direttamente proporzionale alla concentrazione delle cellule in ciascun pozzetto, è importante per le cellule di seme alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti. È anche importante enumerare le cellule in ciascun pozzetto, prima e dopo il test per assicurare che distacco cellulare non si verifica, come mobili, cellule aggregate possono oscurare letture di fluorescenza che possono complicare l’interpretazione dei dati. Per enumerare le cellule, le cellule che esprimono nucleare localizzato istone 2B-GFP (H2B-GFP) sono state utilizzate in questo test. Temperatura controllata, multi-mode, lettori di micropiastre combinano misure di rapide, ad alta velocità (utilizzando un formato di piastra 96 o 384 pozzetti) delle intensità di fluorescenza con formazione immagine di microscopia di cellule viventi a 37 ° C. Quest’ultimo può essere utilizzato per enumerare il numero di cell e osservare l’eventuale formazione di popolazioni distinte delle cellule.

In definitiva, questo test fornisce agli utenti la possibilità di ampliare la loro conoscenza della complessità dei meccanismi di riparazione della membrana di screening per molecole ospitanti o ripristino esogenicamente aggiunto composti che possono controllare la membrana. Il seguente protocollo descrive la procedura sperimentale per misurare l’efficienza risigillazione delle cellule esposte a LLO e valutare gli effetti di un dato farmaco o trattamento cellulare sull’efficienza risigillazione.