In Vivo Två-foton avbildning av kortikala nervceller hos neonatala möss
Summary
Vi presenterar en i vivo två-photon imaging protokoll för imaging hjärnbarken av neonatala möss. Denna metod är lämplig för att analysera utvecklingsmässiga dynamiken i kortikala neuroner, de molekylära mekanismer som styr den neuronala dynamiken, och förändringar i neuronala dynamics i sjukdomsmodeller.
Abstract
Två-foton bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för i vivo analys av neuronala kretsar i hjärnan hos däggdjur. Dock finns ett begränsat antal i vivo imaging metoder för att undersöka hjärnvävnad av levande nyfödda däggdjur. Detta dokument sammanfattar vi ett protokoll för imaging enskilda kortikala nervceller i levande neonatala möss. Detta protokoll innehåller följande två metoder: (1) Supernova system för glesa och ljusa märkning av kortikala nervceller i hjärnans utveckling och (2) ett kirurgiskt ingrepp för bräckliga neonatal skallen. Detta protokoll tillåter observation av tidsmässiga förändringar av enskilda kortikala neuriter under neonatal stadier med högt signal-brus-förhållande. Märkt cell-specifik nedtystning och knockout kan också uppnås genom att kombinera supernovan med RNA-interferens och CRISPR/Cas9 gen redigering system. Detta protokoll kan således användas för att analysera utvecklingsmässiga dynamiken i kortikala neuroner, molekylära mekanismer som styr neuronala dynamics, och förändringar i neuronala dynamik i sjukdomsmodeller.
Introduction
Den exakta ledningar av neuronala kretsar i hjärnbarken är viktigt för högre hjärnfunktioner inklusive perception, kognition, och inlärning och minne. Kortikala kretsar förädlas dynamiskt under postnatal utveckling. Studier har undersökt processen av kortikala krets bildas med histologiska och in vitro- kultur analyser. Dynamiken i krets formation i levande däggdjur har förblev dock mestadels outforskade.
Två-foton mikroskopi har använts för de i vivo analyserna av neuronala kretsar i vuxen mus hjärnan1,2. Dock har endast ett begränsat antal studier på grund av tekniska utmaningar adresserat neuronala krets bildandet i nyfödda möss. Till exempel utförde Carrillo et al. time-lapse bildtagning av klättring fibrer i lillhjärnan i andra postnatala vecka3. Portera-Cailliau et al. rapporterade bildtagning av axoner i kortikala skikt 1 i den första postnatal vecka4. I den aktuella studien sammanfattar vi ett protokoll för observationen av layer 4 kortikala nervceller och deras dendriter i nyfödda möss. Resultat som erhålls genom tillämpning av detta protokoll, som omfattar två metoder, redovisas i vår senaste publikation5. Först använder vi Supernova vector systemet5,6 för märkning enskilda nervceller i neonatal hjärnan. I Supernova systemet, fluorescerande proteinerna används för neuronal märkning är utbytbara och märkta-specifika genen knockdown och redigering/knockout analyser är också möjliga. Det andra beskriver vi ett kirurgiskt ingrepp för kraniala fönster beredning i bräckliga neonatala möss. Tillsammans kan dessa metoder i vivo observation av enskilda nervceller i neonatal hjärnor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet och felsökning:
Det mest kritiska steget i protokollet är avlägsnande av skallen (protokoll steg 3,2). Vid införande följer rakbladet ofta dura, orsakar dural blödningar och skador på hjärnan. Detta kan undvikas genom att tillsätta en droppe av cortex buffert på skallen och ta bort skallen i cortex buffert.
Blödning från dura och huden efter kraniala fönster förberedelse leder till ocklusion av fönstret. För att undvika detta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar T. Sato, M. Kanbayashi och S. Kouyama för deras tekniskt bistånd. Detta arbete var stöds av JSPS KAKENHI Grant nummer JP15K14322 och JP16H06143, Takeda vetenskapsstiftelsen, Stiftelsen Uehara Memorial och den Collaborative Research Project av Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) och KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, och JP15H04263 och Grant-i vetenskaplig forskning på områden som Innovation ”dynamisk reglering av hjärnans funktion av skrot & Build System” (JP16H06459) från MEXT (TI).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Auteurs | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Auteurs | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologie du développement. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
