In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen
Summary
We presenteren een in vivo twee-foton imaging protocol voor beeldvorming van de hersenschors van neonatale muizen. Deze methode is geschikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, de moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en de veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.
Abstract
Twee-foton imaging is een krachtig hulpmiddel voor de analyse in vivo voor neuronale circuits in de hersenen van zoogdieren. Er bestaan echter een beperkt aantal in vivo imaging methoden voor de behandeling van het hersenweefsel van levende pasgeboren zoogdieren. Hierin vatten we een protocol voor imaging-individuele corticale neuronen in levende neonatale muizen. Dit protocol omvat de volgende twee methoden: (1) de Supernova-systeem voor het schaars en heldere labelen van corticale neuronen in de ontwikkelende hersenen, en (2) een chirurgische ingreep voor de kwetsbare neonatale schedel. Dit protocol staat toe de waarneming van de temporele veranderingen van individuele corticale neurites in neonatale fase met een hoge signaal-/ ruisverhouding. Gelabelde cel-specifieke gen zwijgen en knock-out kunnen ook worden bereikt door een combinatie van de Supernova met de interferentie van RNA en CRISPR/Cas9 gene bewerken systemen. Dit protocol kan dus worden gebruikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.
Introduction
De exacte bedrading van neuronale circuits in de hersenschors is essentieel voor hogere hersenfuncties, met inbegrip van waarneming, cognitie, en leren en geheugen. Corticale circuits zijn dynamisch verfijnde tijdens postnatale ontwikkeling. Studies hebben onderzocht het proces van het gebruik van de vorming van de corticale circuit histologische en in vitro cultuur analyses. De dynamiek van de vorming van het circuit in levende zoogdieren heeft bleef echter grotendeels onontgonnen.
Twee-foton microscopie is wijd verbeid gebruikt voor de analyses in vivo voor neuronale circuits in de volwassen muis hersenen1,2. Echter, als gevolg van technische uitdagingen, slechts een beperkt aantal studies hebben aangepakt neuronale circuit vorming in pasgeboren muizen. Bijvoorbeeld uitgevoerd Carrillo et al. de time-lapse beeldvorming van vezels in het cerebellum in de tweede postnatale week3klimmen. Deur-Cailliau et al. rapporteerde de beeldvorming van axonen in corticale laag 1 in de eerste postnatale week4. In de huidige studie vatten we een protocol voor het waarnemen van laag 4 corticale neuronen en hun dendrites in pasgeboren muizen. Verkregen door toepassing van dit protocol, waaronder twee methodieken, resultaten worden gemeld in onze recente publicatie5. Eerst, gebruiken we de Supernova vector systeem5,6 voor het labelen van individuele neuronen in de hersenen bij pasgeborenen. In de Supernova-systeem, de fluorescente proteïnen die gebruikt voor het labelen van de neuronale zijn omruilbare en gelabelde cel-specifieke gen knockdown en bewerken/knock-out analyses zijn ook mogelijk. Ten tweede, beschrijven we een chirurgische ingreep in kwetsbare neonatale muizen voorbereiding craniale venster. Samen kunnen deze methodologieën de in vivo waarneming van individuele neuronen in neonatale hersenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het Protocol en probleemoplossing:
De meest kritische stap van het protocol is het verwijderen van de schedel (Protocol stap 3.2). Op de invoegpositie, het scheermesje vaak houdt zich aan de dura, dural bloeden en schade aan de hersenen veroorzaken. Dit kan vermeden worden door een daling van de cortex buffer op de schedel in toevoegen en verwijderen de schedel cortex buffer.
Bloeden uit de dura en de huid nadat craniale venster voorbereiding tot o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken T. Sato, M. Kanbayashi en S. Kouyama voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummers JP15K14322 en JP16H06143, de Takeda Science Foundation, de Uehara Memorial Foundation en de Collaborative Research Project van Niigata Universiteit hersenen onderzoek instituut 2017-2923 (H.M.) en KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, en JP15H04263 en Grant-in wetenschappelijk onderzoek naar innovatie gebieden “Dynamische regulering van hersenfunctie door afvallen & Build System” (JP16H06459) van MEXT (TI).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Auteurs | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Auteurs | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologie du développement. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
