We presenteren een in vivo twee-foton imaging protocol voor beeldvorming van de hersenschors van neonatale muizen. Deze methode is geschikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, de moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en de veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.
Twee-foton imaging is een krachtig hulpmiddel voor de analyse in vivo voor neuronale circuits in de hersenen van zoogdieren. Er bestaan echter een beperkt aantal in vivo imaging methoden voor de behandeling van het hersenweefsel van levende pasgeboren zoogdieren. Hierin vatten we een protocol voor imaging-individuele corticale neuronen in levende neonatale muizen. Dit protocol omvat de volgende twee methoden: (1) de Supernova-systeem voor het schaars en heldere labelen van corticale neuronen in de ontwikkelende hersenen, en (2) een chirurgische ingreep voor de kwetsbare neonatale schedel. Dit protocol staat toe de waarneming van de temporele veranderingen van individuele corticale neurites in neonatale fase met een hoge signaal-/ ruisverhouding. Gelabelde cel-specifieke gen zwijgen en knock-out kunnen ook worden bereikt door een combinatie van de Supernova met de interferentie van RNA en CRISPR/Cas9 gene bewerken systemen. Dit protocol kan dus worden gebruikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.
De exacte bedrading van neuronale circuits in de hersenschors is essentieel voor hogere hersenfuncties, met inbegrip van waarneming, cognitie, en leren en geheugen. Corticale circuits zijn dynamisch verfijnde tijdens postnatale ontwikkeling. Studies hebben onderzocht het proces van het gebruik van de vorming van de corticale circuit histologische en in vitro cultuur analyses. De dynamiek van de vorming van het circuit in levende zoogdieren heeft bleef echter grotendeels onontgonnen.
Twee-foton microscopie is wijd verbeid gebruikt voor de analyses in vivo voor neuronale circuits in de volwassen muis hersenen1,2. Echter, als gevolg van technische uitdagingen, slechts een beperkt aantal studies hebben aangepakt neuronale circuit vorming in pasgeboren muizen. Bijvoorbeeld uitgevoerd Carrillo et al. de time-lapse beeldvorming van vezels in het cerebellum in de tweede postnatale week3klimmen. Deur-Cailliau et al. rapporteerde de beeldvorming van axonen in corticale laag 1 in de eerste postnatale week4. In de huidige studie vatten we een protocol voor het waarnemen van laag 4 corticale neuronen en hun dendrites in pasgeboren muizen. Verkregen door toepassing van dit protocol, waaronder twee methodieken, resultaten worden gemeld in onze recente publicatie5. Eerst, gebruiken we de Supernova vector systeem5,6 voor het labelen van individuele neuronen in de hersenen bij pasgeborenen. In de Supernova-systeem, de fluorescente proteïnen die gebruikt voor het labelen van de neuronale zijn omruilbare en gelabelde cel-specifieke gen knockdown en bewerken/knock-out analyses zijn ook mogelijk. Ten tweede, beschrijven we een chirurgische ingreep in kwetsbare neonatale muizen voorbereiding craniale venster. Samen kunnen deze methodologieën de in vivo waarneming van individuele neuronen in neonatale hersenen.
Kritische stappen in het Protocol en probleemoplossing:
De meest kritische stap van het protocol is het verwijderen van de schedel (Protocol stap 3.2). Op de invoegpositie, het scheermesje vaak houdt zich aan de dura, dural bloeden en schade aan de hersenen veroorzaken. Dit kan vermeden worden door een daling van de cortex buffer op de schedel in toevoegen en verwijderen de schedel cortex buffer.
Bloeden uit de dura en de huid nadat craniale venster voorbereiding tot o…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken T. Sato, M. Kanbayashi en S. Kouyama voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummers JP15K14322 en JP16H06143, de Takeda Science Foundation, de Uehara Memorial Foundation en de Collaborative Research Project van Niigata Universiteit hersenen onderzoek instituut 2017-2923 (H.M.) en KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, en JP15H04263 en Grant-in wetenschappelijk onderzoek naar innovatie gebieden “Dynamische regulering van hersenfunctie door afvallen & Build System” (JP16H06459) van MEXT (TI).
pK031. TRE-Cre | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from authors |
Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
Titanium bar | Auteurs | – | Custom made (see Figure 1G) |
Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
Titanium plate | Auteurs | – | Custom made (see Figure 2A) |
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |