In Vivo To-foton billeddannelse af kortikale neuroner i Neonatal mus
Summary
Vi præsenterer en i vivo to-foton imaging protokol for imaging hjernebarken af neonatal mus. Denne metode er egnet til at analysere den udviklingsmæssige dynamics af kortikale neuroner, de molekylære mekanismer, der styrer neuronal dynamik og ændringer i neuronal dynamics i sygdomsmodeller.
Abstract
To-foton imaging er et kraftfuldt værktøj i vivo analyse af neuronal kredsløb i hjernen, pattedyr. Dog findes et begrænset antal i vivo billeddannelse metoder for behandlingen af hjernevæv af levende nyfødte pattedyr. Heri opsummere vi en protokol for imaging individuelle kortikale neuroner i levende neonatal mus. Denne protokol omfatter de følgende to metoder: (1) Supernova system for sparsom og lyse mærkning af kortikale neuroner i udviklingslandene hjernen, og (2) en kirurgisk procedure for skrøbelige neonatal kraniet. Denne protokol giver mulighed for observation af tidsmæssige ændringer af individuelle kortikale neurites neonatal etaper med en høj signal-støj-forhold. Mærket celle-specifik genhæmning og knockout kan også opnås ved at kombinere Supernova med RNA-interferens og CRISPR/Cas9 gen redigering systemer. Denne protokol kan således bruges til at analysere den udviklingsmæssige dynamics af kortikale neuroner, molekylære mekanismer, der styrer neuronal dynamics, og ændringer i neuronal dynamics i sygdomsmodeller.
Introduction
Den præcise ledninger af neuronal kredsløb i hjernebarken er afgørende for højere hjernefunktioner herunder perception, kognition, og indlæring og hukommelse. Kortikale kredsløb er dynamisk raffineret under postnatal udvikling. Studier har undersøgt processen af kortikale kredsløb dannelse ved hjælp af histologiske og in vitro- kultur analyser. Men dynamikken i kredsløb dannelse i levende pattedyr er forblevet det meste uudforsket.
To-foton mikroskopi har været meget anvendt i vivo -analyser af neuronal kredsløb i voksen mus hjernen1,2. Men på grund af tekniske udfordringer, kun et begrænset antal studier har behandlet neuronal kredsløb dannelse i nyfødte mus. For eksempel udførte Carrillo et al. den time-lapse billeddannelse af klatring fibre i lillehjernen i den anden postnatal uge3. Portera-Cailliau et al. rapporteret billeddannelse af axoner i kortikale lag 1 i den første postnatal uge4. I den foreliggende undersøgelse opsummere vi en protokol til iagttagelse af lag 4 kortikale neuroner og deres dendritter i nyfødte mus. Resultater, der opnås ved anvendelse af denne protokol, som omfatter to metoder, der rapporteres i vores seneste publikation5. Først bruger vi Supernova vektor system5,6 for mærkning individuelle neuroner i hjernen, neonatal. I ordningen for Supernova fluorescerende proteiner bruges til neuronal mærkning er udskiftelige og mærket celle-specifikke gen knockdown og redigering/knockout analyser er også muligt. For det andet, vi beskrive en kirurgisk procedure for kraniel vindue forberedelse i skrøbelige neonatal mus. Sammen, tillade disse metodologier i vivo observation af individuelle neuroner i neonatal hjerner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen og fejlfinding:
Den mest kritiske trin i protokollen er fjernelse af kraniet (protokol trin 3.2). Ved indsættelse klæber barberblad ofte til dura, forårsager dural blødninger og skader på hjernen. Dette kan undgås ved at tilføje en drop på cortex buffer på kraniet og fjerner kraniet i cortex buffer.
Blødning fra dura og huden efter kranie vindue forberedelse fører til okklusion af vinduet. At undgå dette, vævet klæbende og dent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker T. Sato, M. Kanbayashi og S. Kouyama for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af JSP’ER KAKENHI Grant numre JP15K14322 og JP16H06143, Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation, og den kollaborative forskning projekt af Niigata Universitet Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) og KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, og JP15H04263 og Grant-i videnskabelig forskning på Innovation områder “Dynamisk regulering af hjernefunktion af skrot & Build System” (JP16H06459) fra MEXT (ti).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Auteurs | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Auteurs | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologie du développement. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
