I Vivo To-fotonet avbilding av kortikale nevroner i Neonatal mus
Summary
Vi presenterer en i vivo to-fotonet imaging protokoll for imaging hjernebarken neonatal mus. Denne metoden er egnet for å analysere utviklingsmessige dynamikken i kortikale nevroner, molekylære mekanismer som kontrollerer neuronal dynamikken og endringene i neuronal dynamikk i sykdom modeller.
Abstract
To-fotonet bildebehandling er et kraftig verktøy for i vivo analyse av nevrale kretser i pattedyr hjernen. Imidlertid finnes et begrenset antall i vivo tenkelig metoder for å undersøke hjernevev live nyfødte pattedyr. Her oppsummere vi en protokoll for imaging personlige kortikale nevroner i levende neonatal mus. Denne protokollen inkluderer de følgende to metodikkene: (1) Supernova system for sparsom og lyse merking av kortikale nerveceller i utvikle hjernen, og (2) en kirurgisk prosedyre for skjøre neonatal skallen. Denne protokollen tillater observasjon av tidsmessige endringer av personlige kortikale neurites under neonatal stadier med en høy signal-til-støy-forhold. Merket celle-spesifikke genet stanse og knockout kan også oppnås ved å kombinere Supernova RNA-interferens og CRISPR/Cas9 gene redigering systemer. Denne protokollen kan dermed brukes for å analysere utviklingsmessige dynamikken i kortikale nevroner, molekylære mekanismer som styrer neuronal dynamikk, og endringer i neuronal dynamikk i sykdom modeller.
Introduction
Den nøyaktige kablingen for nevrale kretser i hjernebarken er viktig for høyere hjernefunksjoner inkludert persepsjon, kognisjon, og læring og hukommelse. Kortikale kretser er dynamisk raffinert under postnatal utvikling. Studier har undersøkt prosessen av kortikale krets dannelsen ved hjelp av histologiske og i vitro kulturanalyser. Men har dynamikken i kretsen formasjonen i levende pattedyr vært stort sett uutforsket.
To-fotonet mikroskopi er mye brukt for i vivo -analyser av nevrale kretser i voksen mus hjernen1,2. Men på grunn av tekniske utfordringer, har bare et begrenset antall studier adressert neuronal krets formasjonen i nyfødte mus. For eksempel utført Carrillo et al. tidsinnstilt bildebehandling klatring fibre i lillehjernen i andre postnatal uke3. Portera-Cailliau et al. rapportert avbilding av axons i kortikale lag 1 i første postnatal uke4. Studien oppsummere vi en protokoll for observasjon av lag 4 kortikale nevroner og deres dendrites i nyfødte mus. Resultatene ved å bruke denne protokollen, som inkluderer to metoder, rapporteres i våre siste publikasjon5. Først bruker vi Supernova vektor system5,6 for merking individuelle neurons i neonatal hjernen. I Supernova systemet, fluorescerende proteiner brukes for neuronal merking er utskiftbare og merket celle-spesifikke genet knockdown og redigering/knockout analyser er også mulig. Andre, beskriver vi en kirurgisk prosedyre for kraniale vinduet forberedelse i skjøre neonatal mus. Sammen tillater disse metodene i vivo observasjon av individuelle neurons i neonatal hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avgjørende skritt i protokollen og feilsøking:
Det viktigste trinnet av protokollen er fjerning av skallen (protokollen trinn 3.2). Ved innsetting overholder den razor bladet ofte dura, forårsaker dural blødning og skade på hjernen. Dette kan unngås ved å legge en dråpe cortex buffer på skallen og fjerne skallen cortex buffer.
Blødning fra dura og huden etter skallen vinduet forberedelse fører til okklusjon av vinduet. For å unngå dette, vevet lim og denta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker T. Sato og M. Kanbayashi S. Kouyama for deres kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant tall JP15K14322 og JP16H06143, Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation og de samarbeidende forskning prosjekt av Niigata University hjernen Research Institute 2017-2923 (H.M.) og KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, og JP15H04263 og Grant i vitenskapelig forskning på innovasjon områder “Dynamisk regulering av hjernefunksjon av skrap & nybygg System” (JP16H06459) fra MEXT (ti).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Auteurs | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Auteurs | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Auteurs | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologie du développement. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
