限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離
Summary
ここでは、2 つ小胞細胞の隔離のプロトコル、遠心限外濾過とマウスの気管支肺胞洗浄液のサンプルから細胞小胞を分離する密度勾配遠心法と遠心をについて説明します。両法によりマウスの気管支肺胞洗浄液由来細胞の小胞は定量化され、特徴付けられます。
Abstract
細胞小胞 (Ev) は、通知機能を生理学的および病理学的状態の間に多くの生物学的に重要な役割を果たす新たに発見された細胞レベル下のコンポーネントです。EVs の分離は、各テクニックに固有の制限のため、この分野で主要な挑戦を続けています。密度勾配遠心法で差動遠心は一般的に使用されるアプローチと EV 分離のゴールド スタンダード プロシージャと見なされます。ただし、この手順は、時間のかかる、労働集約的で、一般的に気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルが適さない場合があります低レベルの拡張性の結果します。限外ろ過遠心分離法は簡単な時間と労働効率の良い高回収率と純度をまだ提供して示す.この分離方法は特に少量試料のための EV 分離に適している方法でされる可能性を提案します。
Introduction
エクソソームは、EVs を, 直径 50-200 nm の最小サブセット、シグナリング プロセス1,2,3,4、5の多様なアレイにまたがって複数の生物学的機能を持っています。彼らは主に脂質、蛋白質および核酸6,7,8,9 など貨物分子を介して細胞間コミュニケーションを促進することで細胞およびティッシュの恒常性を支配します。.EV 研究の 1 つの重要なステップは、分離プロセスです。差動遠心 (UC)、密度勾配遠心法 (DGC) の有無は金標準的なアプローチが、この方法には非効率的な EV 回収率と低いスケーラビリティ10などを含む、主要な制限事項,11,12、それは細胞培養上清または高エキソソーム生産試料などの大きなボリューム サンプルへ最高の利用を制限します。利点と限外ろ過、クロマトグラフィー、ビーズや、列ごとマイクロ流体、immunoaffinity 分離サイズ排除など、他の方法の不利な点はよく記述されているとする現代の補足的な手順が開発されて克服し、各アプローチ11,12,の13,14,15の技術的制限を最小限に抑えます。他は UC のメソッド16,17,18に匹敵する純度を提供する代替手法であるフィルター ユニットのナノポーラス膜の限外ろ過遠心分離 (UFC) 示されています。この手法は、代替の分離方法の一つとして考えられます。
気管支肺胞洗浄液 (BALF) では、さまざまな呼吸器の条件19,20,21,22に多数の生物学的機能を持つ EVs が含まれます。BALF 派生 EVs が伴います洗浄回収の限られた量と同様に、ヒトでは、気管支鏡検査手順の侵襲によるいくつかの課題を勉強しています。マウスなどの小型実験動物、数ミリリットルのみ正常肺条件で回復することができます、炎症や線維化肺23より。その結果、下流用差動遠心による BALF の EV の分離のための十分な量を収集できないことがあります。ただし、正しい EV 集団を分離は、EV の生物学的機能を研究するための重要な要因です。効率と効果の微妙なバランスは、よく確立された EV 分離方法に挑戦を続けています。
この現在の調査を示す 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) ナノ膜フィルター ユニットを利用した遠心限外濾過法アプローチは BALF など少量の生体試料に適している.この手法は、簡単に効率的と高純度および BALF 由来の電気自動車の研究をサポートするための拡張性を提供します。
Protocol
動物の使用率および動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイ医療センター (CSMC) でによって承認されました。 1. マウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF) コレクションと準備 BALF コレクション ケタミン (300 mg/kg) と頚部転位によって腹腔内経路を介してキシラジン (30 mg/kg) のカクテルとマウスを安楽死させます。</li…
Representative Results
マウス BALF から EV 分離を行った同じ日に UFC と UC DGC の分離方法を使用して。UFC メソッドは、UC DGC テクニック必要な処理時間の 8 時間に対し、約 2.5-3 h を必要しました。これはバッファーと試薬の準備時間を含んでいませんでした。遠心分離の長い期間の間にいくつか他のタスクを実行できる可能性がありますをそれに留意されたいです。それにもかかわらず、全体…
Discussion
過去数十年間、科学者は生体のホメオスタシスの EVs の意義を解明しています。EVs がその生理活性貨物分子1,21,22,26,27を近隣や遠くの細胞を調節することによって多くの病気プロセスに大きな役割を果すより重要なは、,28,29…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
仕事をサポートするには、(PC) へ NHLBI/NIH 助成金 HL103868 と HL137076 (PC) へ、(PC の場合) にアメリカ心臓協会費と (パソコン) にサミュエル ・ オシン包括的がん研究所 (SOCCI) 肺がん研究賞を受賞。EV ナノ粒子追跡の分析のための Nanosight マシンを提供してくれますヒマラヤスギ シナイ医療センターで Smidt 心研究所に大感謝したいと思います。
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
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Citer Cet Article
Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).