ללא תווית זיהוי של לימפוציטים יחוברו באמצעות הדמיה תלת פאזה כמותית, מכונת למידה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לצורך זיהוי ללא תווית לימפוציט יחוברו באמצעות הדמיה שלב כמותיים באלגוריתם למידה חישובית. מדידות של-tomograms השבירה תלת-ממד של לימפוציטים להציג נתוני תלת-ממד מורפולוגי וביוכימי לתאים בודדים, אשר לאחר מכן ניתוח עם מכונת-learning אלגוריתם זיהוי סוגי תאים.
Abstract
נתאר כאן פרוטוקול לצורך זיהוי ללא תווית לימפוציט יחוברו באמצעות הדמיה כמותיים שלב למידה חישובית. זיהוי של סוגי לימפוציטים חשוב בחקר ואימונולוגיה וכן אבחון וטיפול במחלות שונות. כיום, בשיטות הרגילות לסיווג סוגי לימפוציטים להסתמך על תיוג חלבונים קרום ספציפי באמצעות תגובות אנטיגן-נוגדן. עם זאת, שיטות אלה תיוג לשאת הסיכונים הפוטנציאליים של סירוס ועיקור תאיים. הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על האתגרים הללו על ידי ניצול מהותי ניגודים אופטי נמדד על ידי הדמיה תלת פאזה כמותיים באלגוריתם למידה חישובית. מדידה של תלת-ממד מקדם שבירה (RI) tomograms של לימפוציטים מספק מידע כמותי אודות פנוטיפים של תאים בודדים ומורפולוגיה תלת-ממד. הפרמטרים biophysical מופק את tomograms רי 3D נמדד מכן נותחו באופן כמותי עם מכונת למידה אלגוריתם, הפעלת ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד. אנחנו מודדים את tomograms רי תלת-ממד של לימפוציטים B, CD4 + T ו CD8 + T ומזוהה שלהם סוגי תאים עם למעלה מ- 80% דיוק. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים לימפוציט בידוד, הדמיה תלת-ממד שלב כמותית של למידה חישובית לזיהוי סוגי לימפוציטים.
Introduction
לימפוציטים ניתן לסווג תת השונים לרבות B, המסייע (CD4 +) T, ציטוטוקסיות (CD8 +) T ו- T רגולטורי תאים. לכל סוג של לימפוציט יש תפקיד אחר במערכת החיסון מסתגלת; לדוגמה, B לימפוציטים לייצר נוגדנים, ואילו לימפוציטים מסוג T לזהות אנטיגנים ספציפיים, לחסל תאים חריגים, לווסת B לימפוציטים. לימפוציט פונקציית רגולציה בחוזקה בשליטת ויש הקשורים במחלות שונות, כולל סרטן1, מחלות אוטואימוניות2זיהומים נגיפיים3. לפיכך, זיהוי סוגי לימפוציטים חשוב להבין תפקידיהם pathophysiological במחלות כגון ועבור חיסוני במרפאות.
כיום, שיטות לסיווג סוגי לימפוציטים להסתמך על תגובות אנטיגן-נוגדן על ידי מיקוד חלבוני ממברנה משטח מסוים או סמני פני שטח4. פילוח סמני פני השטח היא שיטה מדויקת כדי לקבוע סוגי לימפוציטים. עם זאת, זה דורש ריאגנטים יקר ונהלים גוזלת זמן. יתר על כן, הוא נושא הסיכונים של השינוי של מבנה החלבונים ממברנה משינוי של פונקציות הסלולר.
כדי להתגבר על האתגרים הללו, הפרוטוקול המתואר כאן מציג ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים שלב כמותיים 3D הדמיה (ה-QPI) באמצעות מכונת למידה5. שיטה זו מאפשרת את סיווג סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד בהתבסס על מידע מורפולוגי מופק ללא תווית הדמיה ממוחשבת של לימפוציטים בודדים. בניגוד קונבנציונאלי פלורסצנטיות טכניקות במיקרוסקופ, ה-QPI מנצל הפצות מקדם שבירה (RI) (מהותי התכונות האופטיות של תאים חיים ורקמות) כמו ניגודיות אופטי6,7. Tomograms רי של לימפוציטים בודדים מייצגים פנוטיפי מידע ספציפי יחוברו של לימפוציטים. במקרה זה, לנצל מערכתית tomograms רי תלת-ממד של לימפוציטים בודדים, אלגוריתם הלמידה המכונה תחת פיקוח היה מנוצל.
תוך שימוש בטכניקות שונות של ה-QPI, tomograms רי תלת-ממד של תאים באופן פעיל שימשו לחקר התא פתופסיולוגיה משום שהם מספקים ללא תווית, כמותיים הדמיה יכולת8,9,10, 11,12,13. בנוסף, חלוקות RI תלת-ממד של תאים בודדים יכול לספק מידע מורפולוגי, ביוכימי, ביו-מכני על תאי. Tomograms רי 3D כבר נעזרו בעבר בתחומי המטולוגיה14,15,16,17, מחלות זיהומיות18,19, 20, אימונולוגיה21, תא ביולוגיה22,23, דלקת24, סרטן25, מדעי המוח26,27, ביולוגיה התפתחותית28, טוקסיקולוגיה 29, מיקרוביולוגיה12,30,31,32.
למרות tomograms רי 3D לספק מידע מורפולוגי וביוכימי מפורט של תאים, הסיווג של לימפוציטים יחוברו קשה להשיג על-ידי פשוט הדמיה תלת-ממדית RI tomograms5. לנצל באופן שיטתי, באופן כמותי את tomograms רי 3D נמדד עבור סיווג סוג תא, אנחנו מנוצל באלגוריתם מכונת למידה. לאחרונה, יצירות אחדות דווח בשלב כמותיים אשר נותחו תמונות של תאים עם מכונת שונים לימוד אלגוריתמים33, כולל הגילוי של מיקרואורגניזמים34, סיווג של חיידקים סוג35 , 36, זיהוי מהיר, ללא תווית של נבגי אנתרקס37, אוטומטי ניתוח של תאי זרע38, ניתוח של סרטן תאים39,40, זיהוי של הפעלת מקרופאג41.
פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים לביצוע ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים ברמת תא בודד באמצעות ה-QPI 3D ולמידה ממוחשבת. זה כולל: 1) לימפוציט בידוד מן העכבר דם, 2) לימפוציט מיון באמצעות זרימת cytometry, 3) תלת-ממד ה-QPI, 4) כמותית הדמיה של תלת-ממד tomograms רי ו 5) תחת פיקוח למידה לצורך זיהוי סוגי לימפוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול המאפשר זיהוי סוגי לימפוציטים ניצול הדמיה תלת פאזה כמותי ולימוד מכונה ללא תווית. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הדמיה שלב כמותיים ובחירת תכונה. עבור ההדמיה הולוגרפית אופטימלית, הצפיפות של תאים צריכה להיות נשלטת כפי שתואר לעיל. יציבות מכנית של התאים חשוב גם להשיג התפ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי את KAIST BK21 + תוכנית, Tomocube, inc., ו את נבחרת מחקר קרן של קוריאה (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). י’ ג’ו מאשר תמיכה מן אחוות לנשיאות KAIST אסאן קרן המלגות מדע הביו-רפואית.
Materials
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
References
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
- Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
- Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
- Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
- Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
- Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
- Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
- Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
- Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
- Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
- Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
- Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
- Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
- Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
- Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
- Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
- Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
- Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
- Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
- Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
- Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
- Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
- Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
- Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
- Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
- Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
- Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
- Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
- Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
- Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
- Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
- Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
- Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
- Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
- Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
- Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).
