JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Markierungsfreie Identifikation von Lymphozyten-Subtypen mit dreidimensionale Quantitative Phase Bildgebung und maschinelles lernen

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildgebung und ein maschinelles lernen-Algorithmus. Messungen der 3D Brechungsindex Schichtbilder von Lymphozyten präsentieren 3D morphologische und biochemische Informationen für einzelne Zellen, die dann mit einem Computerlernen Algorithmus zur Identifizierung von Zelltypen analysiert wird.

Abstract

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles lernen. Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen ist wichtig für das Studium der Immunologie sowie Diagnostik und Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Standard-Methoden zur Klassifizierung von Lymphozyten Arten setzen derzeit, auf Kennzeichnung bestimmte Membranproteine über Antigen-Antikörper-Reaktionen. Diese Kennzeichnung Techniken tragen jedoch die möglichen Risiken der Zellfunktionen zu verändern. Das hier beschriebene Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Ausnutzung der intrinsischen optische Kontraste durch 3D quantitativen Phase Bildgebung und eine Maschine Lernalgorithmus gemessen. Messung der 3D Brechungsindex (RI) Schichtbilder von Lymphozyten liefert quantitative Informationen über 3D Morphologie und Phänotypen der einzelnen Zellen. Die biophysikalischen Parameter aus der gemessenen 3D RI Schichtbilder extrahiert werden dann mit einem Algorithmus für maschinelles lernen, die markierungsfreie Identifizierung der Lymphozyten-Typen auf eine einzelne Zelle Ebene ermöglichen quantitativ analysiert. Wir messen die 3D RI Schichtbilder von B, T CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten und identifiziert ihre Zelltypen mit über 80 % Genauigkeit. In diesem Protokoll beschreiben wir die einzelnen Schritte zum Lymphozyten isoliert, 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen zur Ermittlung Lymphozyten Typen.

Introduction

Lymphozyten lassen sich einteilen in verschiedene Subtypen einschließlich B, Helfer (CD4 +) T, zytotoxische (CD8 +) T und regulatorischen T Zellen. Jeder Lymphozyten-Typ hat eine andere Rolle in der adaptiven Immunsystems; zum Beispiel produzieren B-Lymphozyten Antikörper, wobei T-Lymphozyten spezifische Antigene erkennen, Beseitigung von abnormen Zellen und B-Lymphozyten zu regulieren. Lymphozyten Funktion und Regulation ist fest geregelt und im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs1, Autoimmunerkrankungen2und Virusinfektionen3. So ist die Identifizierung von Lymphozyten Arten wichtig zu verstehen, ihre pathophysiologischen Rollen in solchen Krankheiten und für die Immuntherapie in Kliniken.

Setzen derzeit, Methoden zur Klassifizierung von Lymphozyten Arten auf Antigen-Antikörper-Reaktionen durch gezielte, spezifische Oberfläche Membranproteine oder Oberflächenmarker4. Targeting Oberflächenmarker ist eine exakte und genaue Methode, Lymphozyten Arten zu bestimmen. Es erfordert jedoch teure Reagenzien und zeitaufwändigen Verfahren. Darüber hinaus trägt es Risiken für die Änderung der Membran-Protein-Strukturen und die Veränderung des zellulären Funktionen.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, stellt das hier beschriebene Protokoll die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten Typen mit 3D quantitativen Phase imaging (QPI) und Machine learning-5. Diese Methode ermöglicht die Klassifizierung der Lymphozyten-Typen auf eine einzellige Ebene basierend auf morphologische Informationen aus markierungsfreie 3D-Bildgebung einzelne Lymphozyten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken nutzt QPI Brechungsindex (RI) Verteilungen (intrinsische optischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben) als optischer Kontrast6,7. Der RI Schichtbilder der einzelnen Lymphozyten darstellen phänotypischen spezifische Informationen für Subtypen von Lymphozyten. In diesem Fall um 3D RI Schichtbilder der einzelnen Lymphozyten systemisch nutzen zu können, wurde ein Algorithmus für betreute maschinelles Lernen genutzt.

Mit verschiedenen QPI-Techniken, die 3D RI Schichtbilder der Zellen aktiv werden seit der Studie der Zelle Pathophysiologie weil sie markierungsfreie, liefern quantitative imaging-Funktion8,9,10, 11,12,13. Darüber hinaus können die 3D RI Verteilungen der einzelnen Zellen morphologische, biochemische und biomechanische über Zellen informieren. 3D RI Schichtbilder wurden früher genutzt, in den Bereichen Hämatologie14,15,16,17, Infektionskrankheiten18,19, 20, Immunologie21, Zelle Biologie22,23, Entzündung24, Krebs25, Neurowissenschaften26,27, Entwicklungsbiologie28, Toxikologie 29und Mikrobiologie12,30,31,32.

Obwohl 3D RI Schichtbilder morphologische und biochemische Zellen ausführlich beschrieben, ist die Klassifizierung der Lymphozyten Subtypen schwer zu erreichen durch einfach bildgebende 3D RI Schichtbilder5. Um systematisch und quantitativ die gemessenen 3D RI Schichtbilder zur Zelle Art Klassifikation auszunutzen, haben wir einen Algorithmus für maschinelles Lernen verwendet. Vor kurzem wurden mehrere Werke beschrieben in welchem quantitativen, die Phase Aufnahmen von Zellen analysiert wurden mit verschiedenen Machine learning Algorithmen33, einschließlich den Nachweis von Mikroorganismen34, Klassifikation der bakteriellen Gattung35 , 36, schnellen und markierungsfreie Nachweis von Anthrax-Sporen-37, automatisierte Analyse von Samenzellen38, Analyse von Krebs Zellen39,40und Erkennung von Makrophagen Aktivierung41.

Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte zum markierungsfreie Identifizierung der Lymphozyten-Typen auf die einzelne Zellenebene mit 3D QPI und maschinelles Lernen führen. Dazu gehören: (1) Lymphozyten isoliert von Maus Blut, 2) Lymphozyten sortieren über Flow Cytometry, 3) 3D QPI 4) quantitative Merkmalsextraktion aus 3D RI Schnittbildern und (5) überwachten Lernen zur Ermittlung Lymphozyten Typen.

Protocol

Tierbetreuung und experimentelle Verfahren wurden unter Zustimmung des institutionellen Tier Pflege und Nutzung Ausschuss KAIST (KA2010-21, KA2014-01 und KA2015-03) durchgeführt. Alle Versuche in dieser Studie wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt. (1) Lymphozyten Isolation aus Maus Blut Sobald eine Maus C57BL/6J durch CO2 Einatmen eingeschläfert, 26 G Nadel ins Herz Maus und 0,3 mL Blut zu sammeln. Direkt ins Blut ein Rohr mit 100 U/mL Heparin-Lösung…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Protokoll. Bei der hier vorgestellten Verfahren wir isolierte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), und CD8 + T (n = 112) Lymphozyten. Um Phase und Amplitude Informationen in verschiedenen Winkeln der Beleuchtung zu erhalten, wurden mehrere 2D Hologramme von einzelnen Lymphozyten gemessen durch Veränderung des Winkels der Beleuchtung (von-60 ° bis 60 ° c). In der Regel 50 Hologramme können verwendet werden, um eine 3…

Discussion

Wir präsentieren Ihnen eine Protokoll, die die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Typen, die Nutzung von 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen ermöglicht. Wichtige Schritte dieses Protokolls sind quantitative Phase Bildgebung und Feature-Auswahl. Für die optimale holographische Bildgebung sollte die Dichte der Zellen kontrolliert werden, wie oben beschrieben. Mechanische Stabilität der Zellen ist auch wichtig, eine genaue 3D RI-Verteilung zu erhalten, weil frei verschiebbar ode…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der KAIST BK21 + Programm, Tomocube, Inc., und der National Research Foundation of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) unterstützt. Y. Jo erkennt Unterstützung seitens der KAIST Presidential Fellowship und Asan Stiftung biomedizinische Wissenschaft Stipendium.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image