Yalıtım ve bütün domuz pankreas Decellularization

Bir domuz pankreas ve burada sunulan decellularization yordam diseksiyon Göteborg Üniversitesi etik kuralları izleyin. 1. Decellularization Set-up hazırlanması 3 x 5 mm silikon tüpler kullanarak, seride peristalic pompa deterjan giriş kapsayıcı bağlanın ve via degasser org pankreasta için oda (bkz. Şekil 1). Bir erkek radarı tüp organ odasında ücretsiz sonu bağlayın. Başka bir 3 x 5 mm silikon tüp kullanarak, organ odası deterjan çıkış konteyner üzerinden için perfused deterjan toplamak için peristaltik pompa bağlayın. 2 ml etiketlenmemiş pipet deterjan giriş konteyner ve deterjan çıkış cointainer tüplerde ücretsiz biter takın. Kendin 4 ° C’de tutmak Şekil 1: hazırlık perfüzyon tuzak. 3 x 5 mm silikon tüp kurulum içinde gösterildiği gibi kullanarak, dizide peristaltik pompa, degasser ve organ odası için deterjan giriş kapsayıcı bağlanın. Siyah oklar deterjan giriş kapsayıcı akışı yönünden organ odasına gösterir. Deterjan çıkış, başka bir 3 x 5 mm silikon tüp kullanın ve organ odası üzerinden peristaltik pompa deterjan çıkış kapsayıcı bağlanın. Kırmızı oklar organ odası akışı yönünden deterjan çıkış kapsayıcıya gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 2. Decellularization çözümleri hazırlanması Çözüm 1 (fosfat tamponlu tuz [PBS]): 8 g (137 mM) sodyum klorür, 0.2 g (2.7 mM) potasyum klorür, 1.44 g (10 mM) sodyum fosfat ve (1.8 mM) potasyum fosfat, 0,24 g 1 litre ultrasaf su ekleyin ve karıştırın eriyene kadar. PH 7.4 hidroklorik asit (HCl) için ayarlayın. Toplamda, bu çözümün 3.2 L gereklidir. Çözüm 2 (PBS + heparin): 1 L / çözüm 1, 3,4 mL heparin (17 Uluslararası birimler [IU] /mL) ekleyin. Bu çözüm taze hazırlamak ve soğuk hale gelinceye kadar buz üzerinde tutun. Toplamda, bu çözümün 1,2 L gereklidir. Çözüm 3 (Ultrasaf Su + sodyum azid + disodyum ethylenediaminetetraacetic asit [EDTA]): 1 L / Ultrasaf Su, 1.86 g (5 mM) EDTA ve 200 mg (%0.02) sodyum azid eklemek. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 22 L gereklidir. Çözüm 4 (PBS + sodyum azid + EDTA): 1 L / çözüm 1, 200 mg sodyum azid (%0.02) ve (5 mm) EDTA 1.86 g ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 1 L gereklidir. Çözüm 5 (Ultrasaf Su + sodyum azid): için 1 L ultrasaf su ekleyin (%0.02) sodyum azid 200 mg. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 260 M gereklidir.Not: EDTA SDC ile bir çökelti oluşturur ve hemen yıkama SDC işlemden önce ve sonra kullanılacak beri çözüm 5 dışarıda bırakıldı. Çözüm 6 (SDC + Triton X-100): 940 mL için Ultrasaf Su, 40 g (% 4) ekleyin. SDC, 60 mL (% 6) Triton X-100, (%0.02) sodyum azid 200 mg ve 69,6 mg (0.4 mM) phenylmethylsulfonyl florür (PMSF). Eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? PMSF kullanmadan önce ekleyin. Toplamda, bu çözümün 9,6 L gereklidir. Çözüm 7 (DNaz): DNaz 10.000 Kunitz eklemek birimleri-ı (40 Kunitz adet/mL) Dulbecco’nın PBS CaCl2 ve MgCl2içeren 250 mL. Taze hazırlamak ve hemen kullanın. Çözüm için kullanmadan önce 37 ° C sıcak. Çözüm 8 (PBS + sodyum azid): 1 L / çözüm 1, 200 mg (%0.02) sodyum azid ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın. 4 ° C kullanmadan önce çözüm ne yapıyorsun? Toplamda, bu çözümün 1 L gereklidir. 3. domuz pankreas diseksiyon Not: Bu çalışmada, domuz pancreases üzerinden, heparinized (400 IU/kg) dişi domuzlar bir çiftlik 45 kg ağırlığında euthanized disseke. Domuz diseksiyon tablo sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Tüm karın organları açığa bir neşter kullanarak bir ensizyon xiphoidal işleminden kasık kemiğine (yaklaşık 40 cm) için yapmak. Dalak bulun, duodenal ve bağlantı loblar. Büyük duodenal papilla düzeyini bulun ve sözlü olarak iki ayrı dikiş kullanarak o siteden onikiparmak ligate. Aşağı özofagus iki ayrı dikiş ile ligate ve mide almak makas ile bitişik harfler arasında kesti. Bağ dokusu bağırsağın ulaşmak için iki nokta üst üste ayırın. Pankreas dalak lob için verdiği iki nokta üstüste bağ dokusu ayırın. İki nokta üst üste damar birleştirilmesi (ligasyon) sonra ince bağırsak çıkarın. İnferior mezenterik ven ve inferior mezenterik arter ağaç bulup pankreas caudally görüntülendiği bir dikiş ile ligate. Splenik arter ligate ve dalak Hilus yakın bir dikiş birlikte damar ve klemple dalak kaldırmak için makasla kesti. Duodenal ve bağlantı loblar temizlenir ve vasıl belgili tanımlık son iki ayrı dikiş ile duodenum ligate kadar duodenum izleyin. Portal ven incelemek, karaciğer üzerinden herhangi bir kan kaçağı önlemek ve proksimale bağ için bir dikiş ile ligate. Portal ven decellularization sırasında bir çıkış gibi hizmet vermektedir. İncelemek ve safra kanalını ve iki dikiş ile hepatik arter ligate. Klemple dikiş için kesti. Renal ven altında aort bulmak ve pankreas alan ulaşıncaya kadar kas ve bağ dokusu kranial yönde incelemek. Pankreas nazikçe çevirin ve SMA ve CT olduğu gibi tutmak aort, incelemek ve CT daha üstün ve makas ile SMA daha aşağı aorta kesti. Makasla dokuları çevreleyen kalan kesim ve pankreas çıkar. 4-mm arteriotomy kanül için bağlı bir 50 mL şırınga kullanarak, organ çözüm 2 ile aort yoluyla tüm organ perfuses kadar veya tüm organ soğuk hale gelinceye kadar temizleme. 4. Decellularization için domuz pankreas hazırlanması Pankreas 4 ° C’de veya süreci boyunca buzda tut. Makas kullanarak oniki parmak bağırsağı dikiş kesmek, 50-150 mL Ultrasaf Su 25 mL pipet kullanarak temizlenerek temiz o yiyecek ve tekrar dikiş ile ligate. Aort bir ucunu ve SMA ve CT yanı sıra tüm dalları kaçağı önlemek için dikiş ile ligate. 4-mm arteriotomy kanül aort diğer ucunu takın ve dikiş ile ligate. Çözüm 3 ile pankreas 20 mL/dk decellularization kurulumu kullanarak 1 h için sıvı.Not: hava kabarcığı yok pankreas girin öyle ki çözüm 3 ile pompa tüpler Prefill. Herhangi bir sızdırmazlık için organ her yönden bakmak ve tüm açık damar dalları ile dikişler, portal ven dışında ligate. Çözüm 4-20 ° C’de pankreas decellularization başlayana dondur. 5. decellularization domuz pankreas Pankreas 4 ° C’de erimek Hiçbir hava kabarcıkları deterjan giriş tüpte görülmektedir kadar peristaltik pompa çözüm 3 ile decellularization set-up 20 mL/dk çalıştırın. Pankreas decellularization kapsayıcısına getirin ve deterjan giriş tüp pankreas aort bağlayın. Bir gecede 20 mL/dk 4 ° C’de, çözüm 3 ile perfüzyon tarafından organ yıkama Organ odasında yaptı çözüm dökmek. Çözüm 3 çözüm 5 ile değiştirin ve pankreas 20 mL/dk 4 ° C’de 30 dk için sıvı Organ odası çözümde dökmek. Çözüm 6 eklemek ve pankreas 20 mL/dk 4 ° C’de 8 h için sıvı Organ odası çözümde dökmek. 20 mL/dk 4 ° C’de 96 h için çözüm 5 ile perfüzyon tarafından organ yıkama Organ odası çözümde dökmek. Dulbecco’nın PBS CaCl2 ve 37 ° C’de 30 dk için MgCl2 içeren 500 mL sirkülasyon tarafından DNaz tedavisinde pankreas hazırlamak Organ odası çözümde dökmek. Çözüm 7 250 mL ekleyin ve pankreas 37 ° C’de 20 mL/dk 4 h için sıvı Organ odası çözümde dökmek. 20 mL/dk 4 ° C’de 120 h için çözüm 5 ile perfüzyon tarafından organ yıkama Org çözüm 8’kısa bir süre için 4 ° C’de veya uzun süre-20 ° C’de depolayın. 6. Decellularization doğrulanması Makas kullanarak, 3 – 10 mm biyopsi pankreasın bütün loblar üzerinden kesmek ve onları formaldehit oda sıcaklığında 48 h için düzeltin. Ultrasaf Su 15dk için parçaları yıkayın, onları standart protokolleri takip bir doku işlemcide süreci ve parafin içinde katıştırabilirsiniz. 5-µm bölümleri Microtome kullanarak kesin ve onları standart protokolleri takip Meyer Hematoksilen ve % 0,2 alkollü eozin tarafından (o) leke. Çekirdek kaybı için kontrol etmek için hafif bir mikroskop altında slaytları görüntülemek.Not: Aynı şekilde işlenmiş bir taze doku bir parça bir denetim olarak çekirdek varlığı için kontrol etmek için kullanılabilir.