السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للسل البشري النموذجي في الزرد الكبار استخدام به الممرض الطبيعية متفطره marinum. استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأجهزة الداخلية من الزرد المصابة يمكن أن تكشف عن مجموع المتفطرات الأحمال في الأسماك والاستجابات المناعية للمضيف مع قبكر.
Abstract
متفطره حاليا الممرض البشرية فتكاً مما تسبب في وفاة 1.7 مليون والتهابات 10.4 مليون سنوياً. يسبب التعرض لهذه البكتيريا طائفة واسعة من أمراض في البشر تتراوح بين عدوى معقمة مرض القاتل تتقدم بنشاط. الشكل الأكثر شيوعاً هو السل الكامنة، التي هي غير متناظرة، ولكن لديه القدرة على إعادة تنشيط في مرض مداهم. مؤخرا أثبتت الزرد الكبار والممرض الطبيعية بكتريا مارينوم تكون نموذجا ينطبق على دراسة الطيف واسعة من مرض السل. الأهم من ذلك، يمكن دراسة الكمون عفوية وإعادة تنشيط، فضلا عن الاستجابات المناعية التكيفية في سياق الإصابة المتفطرات في هذا النموذج. في هذه المقالة، نحن تصف طرق العدوى التجريبية للكبار الزرد، جمع الأجهزة الداخلية لاستخلاص الأحماض النووية لقياس الأحمال المتفطرات والاستجابات المناعية المضيف قبل PCR الكمي. في-منزل–وضعت، M. marinum-مقايسة qPCR محددة أكثر حساسية من الأساليب التقليدية والطلاء، كما يكشف أيضا الحمض النووي من المتفطرة غير تقسيم أو نائمة أو ميتة مؤخرا. كما يتم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من نفس الشخص، فمن الممكن لدراسة العلاقات بين الدولة المريضة، والتعبير الجيني المضيف والممرض. النموذج الزرد الكبار للسل وهكذا تقدم نفسها على أنها نظام التطبيق عالية وغير الثدييات في فيفو لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية، ونموذج مقبولة لعلم الأحياء الفقارية شيوعاً. الزرد وقد تم تكييف العديد من مجالات البحوث نمذجة الأمراض البشرية واضطرابات تتراوح بين1 من السرطان وأمراض القلب2 العدوى والدراسات المناعية لعدة البكتيرية 3 و4 من العدوى الفيروسية , 5-وبالإضافة إلى ذلك، قد أحرزت التنمية السابقين الرحم الأجنة الزرد الزرد نموذج شعبية في علم الأحياء التنموي6 وعلم السموم7،8.
في العديد من مجالات البحوث، بما في ذلك الإصابة بالبيولوجيا، ويشيع استخدام اليرقات الزرد شفافة بصريا. تظهر الخلايا المناعية الأولى داخل ح 24 وظيفة التسميد (hpf)، عندما الضامة البدائية هي الكشف عن9. العَدلات هي الخلايا المناعية التالية تظهر حوالي 33 هبف10. وهكذا قابلة اليرقات الزرد للدراسة في المراحل المبكرة من العدوى، ودور الحصانة الفطرية في غياب الخلايا المناعية التكيفية11. ومع ذلك، يوفر الزرد الكبار مع نظامها المناعي التكيفي تعمل بكامل طاقتها طبقة إضافية من التعقيد لتجارب العدوى. يمكن كشف خلايا تي حول 3 أيام بعد الإخصاب12، وب الخلايا قادرة على إنتاج أجسام مضادة الوظيفية قبل 4 أسابيع بعد الإخصاب13. وقد الزرد الكبار جميع النظراء الرئيسيين لنظام المناعة الفطرية وتكيفية الثدييات. تم العثور على الاختلافات الرئيسية بين immune systems الأسماك والبشر في إيسوتيبيس جسم فضلا عن تشريح الأنسجة اللمفاوية. وقد الزرد جسم سوى ثلاثة فصول14، بينما البشر لديهم خمسة15. نظراً لغياب نخاع العظام والغدد الليمفاوية، الأجهزة اللمفاوية الأولية في الأسماك هي الكلي و الغدة الصعترية16 والطحال، والكلى والقناة الهضمية بمثابة أجهزة اللمفاوية الثانوية17. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، مع ترسانتها حصانة كاملة من الخلايا الفطرية وقابلة للتكيف، الزرد الكبار نموذج العالية المطبقة، وسهلة الاستخدام، وغير الثدييات لدراسات التفاعل المضيف الممرض.
الزرد أنشئت في الآونة الأخيرة نموذجا عمليا لدراسة السل18،،من1920،،من2122. السل مرض الهواء الناجم عن بكتريا السل. ووفقا “منظمة الصحة العالمية”، السل تسبب1.7 مليون حالة وفاة في عام 2016، وهو السبب الرئيسي للوفاة ممرض واحد في جميع أنحاء العالم23. الفئران24،25، الأرانب26 و27 من المقدمات غير البشرية نماذج الحيوان الأكثر شهرة في بحوث السل لكن كل وجه قصورها. يشبه نموذج الرئيسيات غير البشرية من الإصابة السل م الأمراض البشرية الأكثر تطابقاً، ولكن استخدام هذا النموذج محدودة بسبب اعتبارات أخلاقية خطيرة. نماذج حيوانية أخرى تعيق المضيف-خصوصية السل م الذي يؤثر على باثولوجيا المرض. طائفة واسعة من نتائج الإصابة والمرض في الأمراض البشرية على الأرجح أكبر مشكلة في نمذجة السل: السل مرض متغايرة جداً تتراوح من تعقيم الحصانة للإصابة الكامنة والنشطة والمعاد تنشيطها28 ، التي يمكن أن يكون من الصعب استنساخها ونموذج تجريبيا.
متفطره مارينوم قريب من السل م مع أورثولوجوس ~ 3,000 البروتينات بنسبة 85 في المائة من الأحماض الأمينية الهوية29. وبطبيعة الحال يصيب M. marinum الزرد المنتجة حبيبية، السمات المميزة لمرض السل، في19،الأجهزة الداخلية في30. خلافا لسائر النماذج الحيوانية المستخدمة في بحوث السل، الزرد تنتج ذرية كثيرة وأنه يتطلب مساحة محدودة فقط والأهم من ذلك، أنها نيوروفيسيولوجيكالي نموذج السل الفقاريات أقل البلدان نمواً المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، تسبب العدوى M. marinum العدوى الكامنة، والمرض النشطة أو التعقيم حتى الإصابة المتفطرات في الزرد الكبار عن كثب محاكاة طيف نتائج مرض السل البشري19، 31 , 32-هنا، يمكننا وصف أساليب لنموذج تجريبي السل الزرد الكبار بحقن M. marinum في تجويف البطن واستخدام PCR الكمي لقياس الأحمال المتفطرات والاستجابات المناعية من الزرد عينات الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا تطبيق يستند إلى qPCR لقياس الأحمال المتفطرات من الحمض النووي المستخرج من الأنسجة المصابة تجريبيا الزرد الكبار. يستند هذا التطبيق على كبسولة تفجير تصميم حول تسلسل الداخلية يدون مباعدة الرنا الريباسي 16S-23S40. ويقدر مجموع الحمل المتفطرات في عينة أسماك استخدام منحنى قيا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل قبل الفنلندي الثقافية مؤسسة (H.L.)، “تامبيري السل مؤسسة” (H.L.، ل. م. ف. M.M.H.، عضو البرلمان)، مؤسسة “الرابطة الفنلندية” لمكافحة السل (سومن توبيركولوسين فاستوستاميسيهديستيكسين Säätiö) (H.L.، M.M.H.، عضو البرلمان)، سيغريد Jusélius مؤسسة (عضو البرلمان)، إميل ألتونن مؤسسة (M.M.H.)، وجين ومؤسسة أركو آتوس (عضو البرلمان) وأكاديمية فنلندا (عضو البرلمان). لينا ماكينن، بيبو لينا حنا وجينا Ilomäki معترف بها للمساعدة التقنية. يعترف الكتاب المختبر الزرد تامبيري لخدمتهم.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
References
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
