Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen
Summary
Primordial germ hücreleri (PGCs) ortak öncüleri sperm ve yumurta vardır. İnsan embriyonik PGCs pluripotent epiblast hücreleri sitokinler etkileşimleri aracılığıyla belirtilir. Burada, biz insan hücreleri transcriptomally embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotency indüklenen pluripotent kök hücreler, PGCs benzeyen inducing bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak.
Abstract
Primordial germ hücreleri (PGCs) germline hücrelerin tümünü ortak öncüleri vardır. Fare embriyo ~ 40 PGCs kurucu nüfusu sitokinler, kemik morfogenetik protein 4 (Bmp4) de dahil olmak üzere için orkestra Etkilenmeler tarafından pluripotent epiblast hücrelerinden indüklenen. İnsan embriyosu, en erken PGCs sarısı sac gebeliğin 3rd haftanın sonunda etrafında endodermal duvara tespit edilmiştir ama insan PGC belirtimi ve erken geliştirme süreci hakkında az şey bilinir. İnsan embriyonik PGCs okuyan teknik ve etik engelleri aşmak için vekil hücre kültür modelleri son zamanlarda pluripotent kök hücrelerden üretilmedi. Burada, biz insan PGC-Like hücre (hPGCLCs) sağlam üretim için bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) astarlanmalıdır pluripotency durumda tutulan orta 48 saat boyunca yeniden programlama 4i saf içinde inkübe, tek kişilik hücrelere ayrışmış ve microwells paketlenmiştir. Uzun süreli hiPSCs ve saf pluripotency Devlet bakımından önemli kromozom anomalileri neden olur ve kaçınılmalıdır. 24 saat içinde daha sonra formu embryoid organları (EBs), 4i ortamına düşük-bağlılık plasticware yüksek konsantrasyon içeren hPGCLC indüksiyon orta sallanan bir koşulda içinde kültürlü bir ek için hiPSCs microwells içinde korunur Rekombinant insan BMP4. EBs daha da hPGCLCs en yüksek verimi elde etmek için sallanan, Sigara yapışık durumda 8 güne kadar kültürlü. İmmünhistokimya, hPGCLCs kolayca güçlü OCT4 neredeyse tüm EBs içinde sadece onların yüzeyinde ifade hücreler olarak algılanır. EBs enzimatik ayrışmış ve FACS zenginleştirme için tabi hPGCLCs CD38 + % 40-45’e kadar hücrelerle olarak toplanabilir verim.
Introduction
Primordial germ hücreleri (PGCs) her iki cinsiyette bütün germline hücrelerinin ortak öncüleri vardır. Çoğu memeli embriyo PGCs gelişiminde bizim bilgi, elde laboratuvar fareler1,2eğitim yoluyla. Embriyonik gün fare embriyo 6.0-6.5, PGC öncüleri 6 veya benzeri az sayıda epiblast ve ~ 40 PGCs onlardan bir şekilde bağlı olarak kemik morfogenetik proteinler Bmp2 ve Bmp4 üzerinden bitişik salgılanan indüklenir kurucu nüfusu bulunmaktadır hücreleri. Sarısı sac gebelik3üçüncü haftanın sonunda etrafında endodermal duvarına erken insan PGCs defa embriyo tespit edildi. Çünkü bu aynı yerde geçirme PGCs fare embriyo gözlemlediği gibi gözlenen insan PGCs geçiş ama değil kurucu nüfus yolunda olduğunu muhtemeldir. Ancak, geri önceki aşamaları takip çalışmalar PGCs veya PGC kara filmin tarih öncesi insan embriyosu içinde eksik olmuştur.
İnsan embriyonik PGCs erişim etik ve teknik engeller nedeniyle meydan okuyor. Bu engelleri aşmak için PGC benzeri hücre kültür modelleri son zamanlarda insan pluripotent kök hücrelerden (PSC) üretilmedi. Pluripotent germline ve üç embriyonik mikrop katmanlar4ayırt etmek için hücresel yetenektir. Hücre dışı matriks proteini ile kaplı yemekleri mTeSR1 Orta (kullanıma hazır, piyasada bulunan Orta astarlanmalıdır pluripotency devlet insan PSC’ler bakımı için formüle edilmiş) insan PSC’ler saklanır, ancak astarlanmalıdır durumlu pluripotency var 4, 2013 yılında Jacob Hanna’nın laboratuar astarlanmalıdır pluripotent hücreler tarafından protein kinaz için kimyasal inhibitörleri içeren saf insan kök hücre Orta (NHSM) açığa ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, saf pluripotency durumuna dönüştürülebileceğini gösterdi p38 MAPK ve büyüme faktörleri LIF, TGF, bFGF5. Saf-pluripotency insan PSC’ler 2015 yılında Hanna ve Azim Surani liderliğindeki bir araştırma grubu insan PGC-Like hücreleri (hPGCLCs) PSC6ilk sağlam üretimi tamamlandı. Daha sonra bizimki de dahil olmak üzere birçok diğer laboratuvarlar, hPGCLCs biraz farklı protokolleri7,8,9,10kullanarak PSC’ler gelen nesil rapor. Bizim çalışma (ki bizim daha önce yayımlanmış çalışma10içinde tablo S1 özetlenmiştir) farklı protokolleri kullanılarak oluşturulan hPGCLCs transcriptomally birbirlerine10‘ a benzer olduğuna dair bir kanıt sağladı. Eldeki kanıtlar insan PGCLCs için küresel epigenetik silme7 ve/veya kemotaktik geçiş10önce aşamasındaki insan embriyonik PGCs benzerliğe destekler.
Çalışmaların fare embriyonik PGCs, fare PGCLCs ve insan PGCLCs (ama yalnızca insan PGCs çok sınırlı erişim) moleküler mekanizmaları PGC belirtiminin fare ve insan1,6, önemli ölçüde farklıdır ortaya koymuştur 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Örneğin, Prdm14 fare embriyo belirtiminde PGC kritik rol oynar, ama insan PGC belirtimi rolü sınırlı1,15görünüyor. Buna ek olarak, bu transkripsiyon faktörleri için fare PGC belirtimi15gereksiz görünüyor ise SOX17 EOMESODERMIN tarafından indüksiyon PGC belirtimi6,11,14için önemlidir. HPGCLCs güçlü kullanarak çalışmalar ilk bu başarılarının önemini bu hücre kültür model insan embriyonik PGCs bir vekil olarak destekler.
Bizim lab’s derin sıralama genomik DNA kopyalama numara analizi, değerlendirilmesi ile ilgili kısa bir süre önce çalışmalar PSC’ler saf pluripotency durumda uzun süreli bakım önemli ölçüde kromozom istikrarsızlık riski artırır göstermiştir ve yapısal anomaliler. Bu olay hem fare18 ve insan19 PSC’ler gözlendi. Hanna/Surani tarafından bildirilen özgün hPGCLC üretim Protokolü insan PSC’ler 4i saf pluripotency orta için en az 2 hafta6muhafaza için geliştirilmiştir. Normal diploit karyotip insan PSC’ler ve PGCLCs korumak için biz hangi insan PSC’ler için bu makalede sunulan sadece 72 saat10, 4i orta maruz değiştirilmiş bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. İnsan iPSCs (hiPSCs) altında astarlanmalıdır pluripotency durumu korunur. Hemen EB oluşumu önce hücreleri 4i saf programlama Orta (değiştirilmiş NHSM orta) 48 saat inkübe. Hücreler sonra ayrışmış ve paketlenmiş forma EBs microwells 4i Orta içinde ek bir 24 saat. EBs rekombinant insan BMP4 8 gün için no-eki kültür için sallanan bir koşul altında hPGCLCs maksimum verim elde etmek için yüksek konsantrasyon içeren hPGCLC indüksiyon ortamda sürdürülür. CD38 + % ~ 40 hücrelerle FACS sıralanabilir tek hücre süspansiyon verim olarak 8 günlük EB kültür sonra hPGCLCs Disosiye EB hücrelerden FACS tarafından ayrılmış olabilir. Yayınlayan diğer ise bizim değişiklikler6önce özgün protokolü de dahil olmak üzere yöntemleri7,8,9, genellikle oluşturmak hPGCLCs içinde özel olmadan kendiliğinden oluşan hücre toplamları yerelleştirme, bizim iletişim kuralı tarafından üretilen hPGCLC embryoid organları (EBs) yüzeyde görülmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokolü kullanarak hPGCLCs sağlam üretimi normal diploit karyotip10ile insan iPSCs üç bağımsız klonları ile doğrulandı. Bu IPSC klonlar aynı insan yenidoğan dermal skin fibroblast hücre kültür10elde edilmiştir. Müfettişler istek üzerine ve altında uygun malzeme transfer anlaşması ve aranjman dondurulmuş canlı insan hücrelerinin nakliye için bu makalenin yazarları tarafından sağlanacaktır. Normal karyotip bizim iletişim kuralı ya da diğer laboratuvarlar tarafından bildirilen kullanarak sağlam hPGCLC üretim için gerekli olup halen bilinmemektedir.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda hPGCLCs hiPSCs11 veya Kyoto Üniversitesi8 Saitou’nın grup tarafından açıklanan bir iletişim kuralı kullanılarak ESCs14 üretimini EOMESODERMIN ifade üzerinde bağımlı olduğunu göstermiştir, bir T-box transkripsiyon faktörü için gerekli İndüksiyon SOX17. SOX17 insan pluripotent kök hücreler6germline ayrımında transkripsiyon faktörü belirleme ana soy olarak çalışmaya görünüyor. EOMESODERMIN EOMES Gen tarafından kodlanır ve EOMES CRISPR/Cas9 nakavt neden neredeyse SOX17 indüksiyon olmaması koşulu11üreten hPGCLC ve diğer genlerin ifade izledi aynı desen SOX17 null nakavt hücreleri. EOMESODERMIN overexpression EOMESindüklenebilir bir vektörde üzerinden-null nakavt hücreleri hPGCLC indüksiyon kültür sırasında etkili bir şekilde kurtarıldı sağlam hPGCLC üretim hem de indüksiyon germline gen, SOX17 de dahil olmak üzere. Buna ek olarak, indüklenen overexpression SOX17 de sağlam PGCLC üretim kurtarıldı ama EOMES inducing olmadan. Bu nedenle, EOMESODERMIN SOX17 bir kritik ters yönde uyarıcı ve bu insan pluripotent kök hücrelerden EOMESODERMIN tek en önemli rol hPGCLC indüksiyon içinde görünüyor. Bizim protokol SOX17 hiPSCs10dakika sonra indükler ama belirlenecek EOMESODERMINE indüksiyon bağımlı bekliyor.
Bu iletişim kuralı astarlanmalıdır pluripotency insan iPSCs mTeSR1 orta ERK bağımsız saf pluripotency için 96 değiştirilmiş saf insan kök hücre Orta (NHSM)5olduğu orta6, yeniden programlama saat için 4i içinde tutulan dönüştürür. Bizim girişimleri aynı insan IPSC klonlar ile başlayan ancak daha düşük hPGCLC verimleri derecelerde orta yeniden programlama kültür 4i sonuçlandı önce diğer ticari olarak mevcut insan IPSC büyüme medyada Bakımı hPGCLCs oluşturmak için. Bu gözlem öneriyor olup diğer ortamlarda daha uzun vadeli adaptasyon hPGCLC üretim artırır veya değil kalır gelecek çalışmalarda belirlenir rağmen önemli ölçüde yeniden programlama insan iPSCs 4i önce astarlanmalıdır pluripotency tam durumunu EB oluşumu 4i orta ve EB farklılaşma hPGCLC ortamda etkiler.
Bizim protokol sonrası hiPSCs üzerinden hPGCLCs yapımıdır güçlü ve son derece verimli üretimi çok sayıda EBs etkinleştirmek microwell plakaları kullanımı sayesinde kısmen tekrarlanabilir (~ 8.000 EBs toplu iş başına) ile üniforma büyüklük (EB başına 3.000 hiPSCs). EBs kolayca üretilen deney bizim protokolünü kullanarak tek bir toplu iş sayısı normal U-alt hücre kültür wells kullanarak yöntemlerden daha çok daha büyük olabilir. Çok sayıda eşit büyüklükte EBs düzgün hPGCLCs ile çivili üretimini küçük molekül ağırlıklı aktivatörleri veya PGC belirtimi etkileyen inhibitörleri tanımlamak için benzersiz fırsatlar yüksek üretilen iş kimyasal gösterimleri sağlayabilir veya onların Epigenetik yeniden programlama gibi biyolojik özellikleri. Böyle EBs da germline hücre toxicants, sadece çevresel kirleticiler ama kemoterapötik ajanlar gibi Ayrıca klinik olarak reçete ilaçlar da dahil olmak üzere çok sayıda toksikolojik değerlendirmeler için yararlı olabilir.
(İ) sağlıklı hiPSCs mTeSR1 hücre dışı matriks proteini, (ii) hücre belirtilen ve kesinlikle tam sayısı aşılamak için üzerinde saklanır kullanımı sunulan protokolü kullanılarak hPGCLCs sağlam ve tekrarlanabilir üretim kritik faktörler Orta değiştirmek ve alt kültür, (III) insan rekombinant BMP4 ve (iv) sırasında sallanan kültür EBs fiziksel zararlarını en aza indirmek için iyi bir sürü seçmek için zamanlamaları izleyin. 2 X veya daha büyük dozlarda BMP4 reaktifler diğer çok gerekli ise, en çok BMP4 reaktif 100 ng/mL konsantrasyonu çalıştı bizim deneyimdir. Diğer taraftan, verim hPGCLCs BMP4 en iyi sürü oldukça azaldı BMP4 daha yüksek dozlarda kullanma (Örneğin, 200 ng/mL). Rekombinant insan BMP4 reaktifler performanslarını hPGCLC üretimi destekleme için birden çok satıcı elde edilen birkaç farklı bir sürü test etmek ve en iyi çok büyük miktarda güvenliğini sağlamak için önerilir.
Diğer iletişim kuralları hPGCLCs hücre toplamları6,8ortasında oluşturabilirsiniz, ancak bizim hPGCLC iletişim kuralı benzersiz bir özelliği hPGCLCs EBs10 (Şekil 8), en dış yüzey katman üzerinde lokalizedir var. Embryoid organları yüzeyinde, dış kabuk, iç kabuk ve çekirdek gibi birden çok farklı katmanları oluşturmak eğilimindedir ve merkezi çekirdeğe bölgeler genellikle besin, oksijen gibi büyüme faktörleri sağlanan form kültür pro hayatta kalan sınırlı kaynağı nedeniyle kangren olan Orta difüzyon20tarafından. Yerelleştirme hPGCLCs EBs yüzeyi merkezi EBs doğru sınırlı difüzyon nedeniyle mümkün kısıtlama olmaksızın doğrudan, süre ve dozda kontrol maruz hPGCLCs, uyuşturucu ya da toksik maddeler için yararlı olabilir farmakolojik veya Toksikolojik çalışmalar.
Oysa kontrol fare PGCLCs gösteri sağlam genom çapında DNA demethylation sürecinden içeren bölgeleri en azından kısmen7,19,20, hPGCLCs genel gDNA demethylation derecesini fare zayıf görünüyor PGCLCS veya PGCs6,7. Transcriptomal profiller hPGCLCs embriyonik PGCs bir İngiliz kontu sahne fare PGCLCs10‘ dan benzeyebilir öneririz. Bu EBs hPGCLC üretim koşul altında uzun süreli kültür gDNA demethylation7artan bir ölçüde neden olduğu bildirilmiştir; Ancak, kültür hPGCLCs EBs veya izole hücreler olarak uzun bir süre daha ileri aşamalarında germline farklılaşma elde edebilirsiniz gelecekteki çalışmaları tarafından belirlenecektir gerekir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Shiomi Yawata ve Şef Owa ilk çalışmaları sırasında teknik yardım almak için kabul edersiniz. Bu çalışmada NIEHS/NIH hibe R01 ES023316 ve R21ES024861 TS ve JHH uçuş görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü (FAMRI) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Primed pluripotency hiPSC culture | |||
| Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
| Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4i hiPSC culture | |||
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
| human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
| human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| 4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
| PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
| BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hPGCLC culture | |||
| Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
| Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
| Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
| Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
| Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
| 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
| Low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemical staining | |||
| BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
| Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
| OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
| ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
| Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolating hPGCLC | |||
| Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
| Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |
References
- Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), 245-252 (2014).
- Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
- De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
- Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
- von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
- Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
- Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
- Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
- Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
- Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).
- Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
- Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
- Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
- Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
- Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
- Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).
