Поколения клеток человека первичных зародышевых клеток как на поверхности Embryoid органов от загрунтовать плюрипотентности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Первичных зародышевых клеток (PGCs) являются общие прекурсоров спермы и яйца. Человеческих эмбриональных PGCs указаны от плюрипотентных клеток Эпибласт через взаимодействия цитокинов. Здесь мы описываем протокол 13-дневный заставить клетки человека transcriptomally, напоминающие PGCs на поверхности embryoid органов от загрунтовать плюрипотентности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Abstract
Первичных зародышевых клеток (PGCs) являются общие прекурсоров всех клеток микрофлорой. Эмбрионов мыши основателей население ~ 40 PGCs индуцированной из плюрипотентных клеток Эпибласт организовали подверженности цитокинов, включая костный морфогенетический белок 4 (Bmp4). В человеческих эмбрионов ранние PGCs были определены на стенках эндодермы желточного мешка примерно в конце 3-й недели беременности, но мало что известно о процессе человеческого PGC спецификации и их раннего развития. Чтобы обойти технические и этические барьеры изучения человеческих эмбриональных PGCs, суррогатной клетки культуры модели были созданы недавно от плюрипотентных стволовых клеток. Здесь мы описываем 13-дневный протокол для надежной производства клеток человека PGC-Like (hPGCLCs). Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) поддерживается в состоянии загрунтовать плюрипотентности инкубировали в 4i наивными, перепрограммирование среднего за 48 часов, отделить в отдельные ячейки и упакованы в microwells. Длительное поддержание hiPSCs в состоянии плюрипотентности наивно вызывает значительные хромосомных аберраций и следует избегать. hiPSCs в microwells поддерживаются на дополнительные 24 часа в средне 4i формы embryoid органов (EBs), которые затем культивировали в низкой присоединение пластик под условие качания в среде индукции hPGCLC, содержащие высокую концентрацию Рекомбинантный человеческий BMP4. EBs далее культивировали на срок до 8 дней в качания, non сторонник условие для получения максимальной урожайности hPGCLCs. По иммуногистохимия hPGCLCs легко обнаруживаются как клетки, решительно выражая OCT4 в почти всех EBs исключительно на их поверхности. Когда EBs ферментативно отделить и подвергнут обогащению СУИМ, hPGCLCs могут быть собраны в CD38 + клетки до 40-45% доходность.
Introduction
Первичных зародышевых клеток (PGCs) являются общие прекурсоров всех микрофлорой клеток в обоих полов. Большая часть наших знаний о развитии PGCs в млекопитающих эмбрионы были получены путем изучения лабораторных мышей1,2. В эмбриональных день 6,0-6,5 зародышей мыши 6 или аналогичных небольшое количество прекурсоров PGC расположены в Эпибласт и основателей население ~ 40 PGCs индуцированной из них образом зависит от костных морфогенетических белков БМП2 и Bmp4, выделяется из прилегающих клетки. Ранних человека PGCs, пока установлено в эмбрионы были на стенках эндодермы желточного мешка в примерно в конце третьей недели гестации3. Потому что это то же место, как перенос PGCs наблюдаются в мыши эмбрионов, вполне вероятно, что наблюдаемое человека PGCs были на пути миграции, но не основателей населения. Однако, исследования, отслеживания обратно ранних стадиях PGCs или PGC пропали прекурсоров в человеческих эмбрионов.
Доступ к человеческих эмбриональных PGCs является сложной задачей из-за технических и этических препятствий. Чтобы преодолеть эти препятствия, PGC-подобных клеток культуры модели были созданы недавно от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (Чок). Плюрипотентности является сотовой возможность дифференцировать в микрофлорой и три эмбриональных зародышевых4. Тогда как человека ЦОНов поддерживается в mTeSR1 среде (готовые к использованию, коммерчески доступных средний, разработаны для поддержания человеческого ЦОНов в государстве загрунтовать плюрипотентности) на блюда с белков внеклеточного матрикса покрытием имеют загрунтовать государство плюрипотентность 4, в 2013 году Якоб Hanna лаборатории показали, что загрунтовать плюрипотентности клетки могут быть преобразованы в состоянии плюрипотентности наивно, подвергая наивно носитель стволовых клеток человека (NHSM), содержащий химических ингибиторов протеинкиназы ERK1/2, GSK3, JNK, рок, Петропавловск, и p38 MAPK, а также факторы роста LIF, TGF, bFGF5. От человека ЦОНов наивно плюрипотентности в 2015 году исследовательская группа, возглавляемая Ханна и Azim Surani осуществляется первый надежный производство клеток человека PGC-Like (hPGCLCs) от Чок6. Позже несколько других лабораторий, в том числе наша, сообщил поколения hPGCLCs от Чок, используя несколько различных протоколов7,8,9,10. Наше исследование представил доказательства того, что hPGCLCs, созданный с использованием различных протоколов (которые резюмируются в таблице S1 из наших ранее опубликованные исследования10) являются transcriptomally аналогичны друг другу10. Имеющиеся доказательства подтверждают сходство человека PGCLCs в ранней стадии человеческих эмбриональных PGCs до глобальной эпигеномные стирания7 или10эозинофилов миграции.
Исследования мыши эмбриональные PGCs, мыши PGCLCs и человека PGCLCs (но с лишь весьма ограниченный доступ к человеческой PGCs) показали, что молекулярные механизмы PGC спецификации значительно отличаются между мышью и человека1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Например Prdm14 играет важнейшую роль в спецификации PGC в эмбрионов мыши, но его роль в человека PGC спецификации кажется ограниченное1,15. В отличие от индукции SOX17 на EOMESODERMIN имеет важное значение для PGC Спецификация6,11,14, в то время как эти факторы транскрипции показаться необязательным для мыши PGC спецификации15. Эти первоначальные успехи исследований с использованием hPGCLCs решительно поддерживают важность этой модели культуры клеток как суррогат человеческих эмбриональных PGCs.
Недавно опубликованные исследования с участием нашей лаборатории глубокую последовательности оценки геномной ДНК копии номер анализа, показали, что длительное ведение ЦОНов в государстве плюрипотентности наивно значительно увеличивает риск хромосомной нестабильности и структурные аномалии. Это явление было отмечено с мыши18 и человека19 УИК. Исходный протокол производства hPGCLC, сообщает Ханна/Сурани был разработан для человека Чок, поддерживается в среде плюрипотентности наивно 4i для по крайней мере 2 недели6. Для сохранения нормальной диплоидных кариотипа человека ЦОНов и PGCLCs, мы разработали измененный Протокол, в котором человека ЦОНов подвергаются 4i средством лишь 72 часов10, которая представлена в этой статье. Человеческого iPSCs (hiPSCs) поддерживаются под загрунтовать плюрипотентности государства. Непосредственно перед EB формирования клетки инкубируют в 4i наивно перепрограммирования среднего (изменение NHSM средний) на 48 часов. Клетки затем отделить и упакованы в microwells форме EBs на дополнительные 24 часа в среде 4i. EBs поддерживаются в среде индукции hPGCLC, содержащие высокую концентрацию рекомбинантного человеческого BMP4 под условие качалки для без вложение культуры на срок до 8 дней получить максимальный доход по hPGCLCs. После 8-день культуры EB hPGCLCs может быть изолирована от диссоциированных EB клеток СУИМ, как CD38 + клеток с до ~ 40% доходность в СУИМ сортируемыми одноклеточного подвеска. В то время как другие опубликованные методы,78,9, включая оригинальный протокол перед нашей модификации6, обычно генерируют hPGCLCs в спонтанно сформированных клеток агрегатов без конкретных Локализация, hPGCLC, производимые нашей протокола наблюдаются на поверхности embryoid органов (EBs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Надежного производства hPGCLCs по Протоколу описанные здесь было подтверждено с трех независимых клоны человека iPSCs с нормальной диплоидных кариотипа10. Эти клоны iPSC были получены от культуры фибробластов клетки же дермы кожи человека новорожденных10. Они будут предоставляться авторами этой статьи для следователей по запросу и по соглашению передачи соответствующих материалов и доставка договоренности замороженных живых клеток человека. В настоящее время неизвестно о том, требуется ли нормальный кариотип для надежной hPGCLC производства с помощью нашего протокола, или тех, кто сообщил другими лабораториями.
Недавние исследования показали, что производство hPGCLCs из hiPSCs11 или ЭСК14 с помощью описанных группой Сайто в университете Киото8 протокола зависит проявление EOMESODERMIN, T-бокс транскрипционный фактор требуется для индукция SOX17. SOX17, как представляется, функционировать в качестве основной линии, определяющим фактором транскрипции микрофлорой дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток6. EOMESODERMIN кодируется геном EOMES , нокаут ТРИФОСФАТЫ/Cas9 EOMES вызвало почти полное отсутствие индукции SOX17 в hPGCLC, производства состояния11, и экспрессии генов, другие следуют той же модели SOX17-значение null нокаут клетки. Сверхэкспрессия EOMESODERMIN от индуцибельной вектор в EOMES-ячейки значение null нокаут во время индукции hPGCLC культуры эффективно спасли надежные hPGCLC производства, а также индукции микрофлорой генов, в том числе SOX17. В отличие от индуцированного Сверхэкспрессия SOX17 также спасли надежного производства PGCLC но не вызывая EOMES. Таким образом EOMESODERMIN является критическим вверх по течению индуктором SOX17, и это кажется одной наиболее важную роль EOMESODERMIN в hPGCLC индукции от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Наш протокол вызывает SOX17 в hiPSCs10, но ее зависимости индукции EOMESODERMINE ждет, чтобы быть определены.
Этот протокол преобразует загрунтовать плюрипотентности человека iPSCs поддерживается в средне mTeSR1 Эрк независимые наивно плюрипотентности 96 часов в 4i перепрограммирования средних6, который является изменение наивно стволовых клеток человека среднего (NHSM)5. Наши попытки создания hPGCLCs начиная с же человека iPSC клонов, но поддерживается в других СМИ коммерчески доступных человека iPSC роста до культуры в 4i перепрограммирования средних привело к той или иной степени снижения урожайности hPGCLC. Хотя в будущих исследованиях определяться улучшает производства hPGCLC ли не остается долгосрочной адаптации в других средствах массовой информации, это наблюдение предполагает, что точное состояние загрунтовать плюрипотентности человека iPSCs до 4i перепрограммирования значительно воздействие EB формирования 4i среднего и EB дифференциации в hPGCLC среде.
Производство hPGCLCs из hiPSCs после нашего протокола является надежным и очень воспроизводимость, частично благодаря использованию микрорезервуар пластин, обеспечивающие эффективное производство большое количество EBs (~ 8000 EBs в пакете) с размером единой (3000 hiPSCs за EB). Количество EBs, легко производится в одном пакете эксперимента с помощью нашего протокола может быть гораздо больше, чем методы с использованием регулярных U-дно клетки культуры скважин. Производство большого количества одинаково размера EBs равномерно шипованных с hPGCLCs могут предоставляют уникальные возможности для определения малого молекулярного веса активаторов или ингибиторов, затрагивающих PGC спецификации высокой пропускной способностью химических отсевов или их биологические характеристики как эпигеномные перепрограммирования. Такие EBs также может быть полезным для токсикологические оценки большого числа герминальных клеток ядовитых веществ, включая не только загрязняющих окружающую среду, но также клинически предписанные лекарства, такие как химиотерапевтических агентов.
Критическими факторами производства надежных и воспроизводимых hPGCLCs с использованием представленные протокол включают в себя (i) использование здорового hiPSCs, в mTeSR1 на белков внеклеточного матрикса, (ii) чтобы прививать точное количество клеток как указано и строго Следуйте тайминги среднего изменения и субкультуры, (iii) чтобы выбрать хороший много человеческого рекомбинантного BMP4 и (iv) для сведения к минимуму физические повреждения EBs во время раскачивания культуры. Это наш опыт, что лучшие много реагента BMP4 работал в концентрации 100 нг/мл, в то время как другие много реагентов BMP4 требуется 2 X или более доз. С другой стороны, доходность hPGCLCs производства с использованием лучших много BMP4 скорее уменьшилось в более высоких дозах BMP4 (например, 200 нг/мл). Мы рекомендуем, чтобы проверить несколько разных много рекомбинантного человеческого BMP4 реагентов, полученных от нескольких поставщиков для их деятельности в поддержку hPGCLC поколения и обеспечить большое количество лучших много.
Уникальной особенностью нашего hPGCLC протокола является, что hPGCLCs локализованы на внешней поверхности слой EBs10 (рис. 8), в то время как другие протоколы могут генерировать hPGCLCs в середине ячейки агрегатов6,8. Embryoid органы, как правило, образуют несколько различных слоев поверхность, внешняя оболочка, внутренней оболочки и ядро, и в основных регионах часто некротические за ограниченный запас питательных веществ, кислорода, а также про выжившие факторы роста предусмотрено формы культуры средняя диффузия20. Локализация hPGCLCs на поверхности EBs без возможных ограничений из-за ограниченного распространения к центр EBs может быть полезным для прямых, время контролируемые и доза облучения hPGCLCs наркотиков или токсичных веществ для фармакологической или Токсикологические исследования.
В то время как мыши PGCLCs шоу надежные генома всей ДНК деметилирования с участием импринтинг контролировать регионов по крайней мере частично7,19,20, степени деметилирования глобальных геномная ДНК в hPGCLCs кажется слабее, чем мыши PGCLCS или PGCs6,7. Transcriptomal профилей предполагают, что hPGCLCs могут быть похожи на более ранней стадии эмбриональных PGCs чем мыши PGCLCs10. Сообщалось, что длительное культуры EBs в условиях hPGCLC производства вызвало увеличение степени деметилирования геномная ДНК7; Однако ли продолжительный период культуры hPGCLCs в EBs или как изолированные клетки можно добиться более продвинутых стадиях дифференцировки микрофлорой должна определяться будущих исследований.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем Yawata музыку и Chie Owa для оказания технической помощи в ходе первоначальных исследований. Это исследование было поддержано NIEHS/низ грантов R01 ES023316 и R21ES024861 в TS и Грант JHH стюардесса институт медицинских исследований (FAMRI).
Materials
| Primed pluripotency hiPSC culture | |||
| Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
| Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4i hiPSC culture | |||
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
| human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
| human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| 4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
| PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
| BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hPGCLC culture | |||
| Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
| Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
| Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
| Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
| Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
| 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
| Low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemical staining | |||
| BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
| Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
| OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
| ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
| Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolating hPGCLC | |||
| Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
| Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |
References
- Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), 245-252 (2014).
- Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
- De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
- Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
- von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
- Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
- Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
- Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
- Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
- Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).
- Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
- Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
- Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
- Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
- Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
- Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).
