プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

1. Primed 多能性の状態で hiPSCs の培養 細胞外基質タンパク質被覆料理の準備 マトリゲル (細胞外マトリックス蛋白質)、冷蔵庫や寒い部屋で氷の上を一晩解凍 (部屋の温度または温水浴では解凍しないでください)。因数のマトリックス蛋白質 (〜 200 μ L; 硫酸の量は各バッチについては、製造元によって決定され、バイアルのラベルに記載) 無菌低バインド遠心分離機管または氷の上細胞凍結保存チューブに。細胞外マトリックス蛋白質を凝固しないように調剤中に冷たい保つために重要です。因数-80 ° C で保存します。 25 mL と 1 つの因数を希釈する細胞外マトリックス蛋白質と細胞培養プラスチック皿をコート、冷たい DMEM/F12、3品 10 cm に広がる (~ 8 mL/皿)。少なくとも 1 時間は室温で料理を孵化させなさい。コーティング後は、パラフィルムを使用し、室温で 1 週間保存、料理を封印できます。 プライム多能性 hiPSCs の接種の直前に料理から媒体を吸い出しなさい。媒体またはカルシウム/マグネシウム無料リン酸緩衝生理食塩水 [PBS(-)] でコーティングされた皿を洗う必要はありません。 プライム多能性の状態による文化の開始 MTeSR1 15 mL 遠心管中の 10 mL に 50 mm Y27632 2 μ L [Rho 関連キナーゼ (ロック) の阻害剤] を追加します。1 mL の細胞株を凍結からの 1 つの 10 cm 皿で培養を開始するロック 10 mL の阻害剤添加培地の 2 つの管を準備します。同じ日に Y27632 添加培地を使用します。Y27632 補足 5 分の 37 ° C の水浴中を prewarm します。注: このプロトコルは、hiPSCs mTeSR1 の維持とうまく動作します。HiPSCs はさまざまな人間の PSC の成長を支える他のメディアに維持されるとき度プライミングまたは素朴な多能性 hPGCLCs の収量大幅異なる場合があります。注: 完全な mTeSR1 の寿命は 4 ° C で 2 週間、-20 ° C が再凍結原因貧しいパフォーマンスで 6 ヶ月。使用するまでの-20 ° C で mTeSR1 40 mL 因数が確定します。 プライム多能性によるフローズン タイプ (1 mL 凍結保存中の 10 の6セル × 1.0 〜 3.0) のバイアルを解凍 37 ° C の水浴を使用します。解凍の完了後すぐに prewarmed Y27632 補完媒体の 1 つの管 (10 mL) にバイアルの内容全体を転送します。 300 × g、室温で遠心分離細胞懸濁液 8 分上澄みを廃棄し、10 ml の細胞ペレットを再懸濁します prewarmed Y27632 補足他のチューブから。 細胞外基質タンパク質被覆 10 cm 皿に細胞懸濁液を均等に分散します。三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) に料理を配置します。低酸素分圧下による文化を維持します。 変化 (Y27632 なし mTeSR1) 毎日。ROCK 阻害剤 (Y27632) は、単一のセルに解離直後後による生存のため重要です。HiPSCs 付着細胞外基質タンパク質被覆面に均等に配置された小さな骨材として一度 > (これは通常接種後 16 時間以内に完了) 10% の confluency Y27632 が不可欠であります。Y27632 せず解離 hiPSCs 接種後早い中型の変更には、ほぼ完全な細胞死を引き起こす可能性があります。 継プライミング多能性hiPSCs注: 植民地は、効果的な成長領域の約 80% を占めている場合、通路に多能性 hiPSCs が準備万端。正しい手順で継と密度実験的再現性にとって重要です。HPGCLC 誘導の効率は冷凍ストック (1 つまたは 2 つの通路を含む) から、または一ヶ月開始後 6 日差による文化ではないしてきました (を含む > 10 通路)。HPGCLC の誘導効率は定量的に評価できないが 2 ヶ月以上維持 hiPSCs から完了しました。 15 mL 遠心管の細胞解離酵素の混合物の 4 mL と 5 分間室温に釣り合います。 Prewarm 10 mL 15 mL 遠心分離機で PBS(-) 管 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。 10 mL mTeSR1 15 mL 遠心管中に 50 mm Y27632 2 μ L (ROCK 阻害剤) を追加します。ロック 10 mL の阻害剤添加培地の 2 つの管を準備し、同じ日に使用します。別の 15 mL 遠心管中 Y27632 を追加せず 5 mL mTeSR1 を取る。Y27632 ± 5 分の 37 ° C の水浴中を prewarm します。注: 1.3.3 準備したすべての媒体因数 Y27632 を含めることができます。 Prewarmed 10 mL PBS(-) で一度 10 cm 皿とリンス細胞から古い培地を吸引します。PBS(-) を破棄し、皿に解離酵素の 4 つの mL を追加します。CO2インキュベーターで皿を置きます (トライ ガス孵卵器は必要ではないが) ~ 4 分セルを下から切断まで。単一細胞懸濁液を上下に優しくピペットで移しなさい細胞。 (15 mL チューブの容量が約 9 mL) Y27632 なし 5 mL の培地を含む prewarmed チューブによる単一細胞懸濁液に転送します。常温で 8 分間 300 x g 細胞懸濁液を遠心します。 上澄みを廃棄し、10 ml Y27632 を含む prewarmed 中の細胞ペレットを再懸濁します。 40 μ m セル ストレーナーを使用して細胞凝集塊を削除し、コールター カウンターを用いた細胞密度を決定します。 10 mL の細胞外基質タンパク質被覆 10 cm 皿を接種するに 10 の6セル × 3.0 を達成するために prewarmed Y27632 添加培地で細胞を懸濁液を希釈します。三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) 接種の皿を配置します。 変化 (Y27632 なし mTeSR1) 毎日。 2. hPGCLCs の生成 注: ~ 80% の confluency (約 107セル) に 10 cm 皿 (mTeSR1 培地、細胞外基質タンパク質被覆) による細胞に達すると次の手順を開始します。 細胞外基質タンパク質被覆料理 (1 日) の準備 氷の上の細胞外マトリックス蛋白質の 1 つの因数を解凍し、冷たい DMEM/F12 の 25 mL で希釈します。 6 ウェル プレート (1 mL/ウェル) に希釈した細胞外マトリックス蛋白質を調剤します。1 つの因数は、24 ウェル (4 版) に塗るに十分です。少なくとも 1 時間は室温でプレートを孵化させなさい。未使用のコーティング プレートを封印し、室温で 1 週間保存できます。 プライミング多能性 hiPSCs の接種の直前にプレートから培地を吸引します。媒体または PBS(-) でコーティングされた皿を洗う必要はありません。 細胞外基質タンパク質被覆板 (日 1) プライム多能性 hiPSCs の接種 15 mL 遠心管の細胞解離酵素の 4 mL と 5 分間室温に釣り合います。 Prewarm 10 mL 15 mL 遠心分離機で PBS(-) 管 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。 35 mL mTeSR1 50 mL 遠心管中に 50 mm Y27632 7 μ L (ROCK 阻害剤) を追加します。同じ日に Y27632 添加培地を使用します。合計 70 mL Y27632 補完媒体の 2 つの管を作るし、15 分の 37 ° C の水浴中に prewarm。 Prewarmed 10 mL PBS(-) で一度 10 cm 皿とリンス細胞から古い培地を吸引します。PBS(-) を破棄し、皿に細胞解離酵素の 4 つの mL を追加します。CO2インキュベーターで皿を置きます (トライ ガス孵卵器は必要ではないが) ~ 4 分セルを下から切断まで。単一細胞懸濁液を上下に優しくピペットで移しなさい細胞。 による単一細胞懸濁液を 10 mL Y27632 補完媒体を含んでいる prewarmed のチューブに転送します。常温で 8 分間 300 x g 細胞懸濁液を遠心します。 上澄みを廃棄し、10 mL prewarmed Y27632 添加培地で細胞ペレットを再懸濁します。 細胞凝集塊を削除し、コールター カウンターを用いた細胞をカウントするセルこし器 (40 μ m 孔サイズ) を通って細胞懸濁液をフィルターします。 50 mL prewarmed Y27632 添加培地で細胞 106 x 5.0 による単一細胞懸濁液を希釈します。 (4 プレート、24 ウェル) コーティング 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL セル中断 (105セル × 2.0) を接種します。セルは、各ウェルに均等に分布していることを確認します。三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) で細胞培養皿を配置します。注: 菌細胞密度とそれぞれに均等に分布も重要です。10 cm 料理 hiPSCs の接種は、他の地域よりも有意に高い細胞密度を引き起こす可能性があります。HiPSCs 単一セルの細胞密度も 6 ウェル プレートをより簡単に実現できます。 接種後 24 時間は (せずに Y27632) 2 mL/ウェル mTeSR1 媒体を変更します。 プライム多能性の状態 hiPSCs の 4i-ナイーブ (ERK 独立) 多能性細胞 (3 日目と 4 日目) への変換 4i 完全な素朴な多能性メディア (3 日目と 4 日目) 次のように 50 mL 遠心管中の準備: 4i 基礎培地 50 mL、30 mM CHIR99021 10 mM PD0325901、20 mM BIRB796、50 mm SP600125 5 μ L の 5 μ L の 5 μ L の 5 μ L、と 50 mm Y27632 5 μ L。注:-80 ° C で融解 4i 基礎培地を保存、冷蔵庫で一晩。使用直前に新鮮な 4i 完全培地を準備します。4i 化学物質 (CHIR、PD、BIRB、および SP) の強いライトへの露出を避けてください。4i 完了を格納しないでください 4 ° C で中程度または一晩冷凍以上。 暖かい 50 mL 4i 完全培地を 15 分変更中の 37 ° C 水のバッチでは、接種後 48 ~ 72 時間で 4i 完全培地 (2 mL/も) を prewarmed しました。中型の変更の厳密なタイミングは、高 hPGCLC の収量および実験的再現性を達成するために重要です。注: 4i による文化の密度はこの条件の下で高いと, 接種後 48-72 時間でコンフルエントになるが、これは正常です。 マイクロウェル プレート (日 5) を用いた EB 形成 4i 完全培地 50 mL 遠心管中の 50 mL を準備し、使用する前に 〜 15 分の 37 ° C の水浴で prewarm。 使用する前に 〜 15 分の 37 ° C の水浴で 50 mL 遠心管中 prewarm 35 mL DMEM/f12 キー。 マイクロウェル プレートを準備します。 マイクロウェル プレート 8 アクティブな井戸に 5% (w/v) フィルター滅菌プルロニック F-127 洗剤を追加 (材料の表を参照してください 0.5 mL/ウェル)。 室温、5 分で気泡のないことを保証する倒立顕微鏡検査マイクロウェルの 1,000 x g でマイクロウェル プレートを遠心します。洗剤とマイクロウェルをコートに室温で 30 分間マイクロウェル プレートを残します。 Prewarmed DMEM/f12 キーでピペッティングとリンスの井戸によってマイクロウェル プレートの井戸から洗剤を破棄 (2 mL/よく)。 常温で 1,000 x g で 5 分間気泡のないことを保証する倒立顕微鏡で検査マイクロウェル マイクロウェル プレートを遠心します。注: 空気の泡はまだマイクロウェルで観察されるとき、マイクロウェル シートは井戸の底にまだしっかりと接着されている場合を調べます。 Prewarmed DMEM/f12 キーでピペッティングとリンスの井戸によってマイクロウェル プレートの井戸から DMEM/F12 を破棄 (2 mL/よく)。 2.4.3.3 – 2.4.3.4 の手順を繰り返します。 マイクロウェル プレート (1 mL/井戸) のリンスの井戸に 4i 完全培地を追加します。残り 4i 完全培地を 37 ° C の水浴において。 常温で 1,000 x g で 5 分間気泡のないことを保証する倒立顕微鏡で検査マイクロウェル マイクロウェル プレートを遠心します。 4i hiPSCs の接種まで (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) の三ガス インキュベーターでマイクロウェル プレートを配置します。 マイクロウェル プレート 4i Ips の接種 15 mL 遠心管の細胞解離酵素の 13 mL と 5 分間室温に釣り合います。 Prewarm 50 mL PBS(-) 50 mL 遠心分離機で管 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。 ナイーブによる細胞文化とリンス細胞 prewarmed 2 mL で 1 回の 24 の井戸から古い培地を吸引/PBS(-) をよきます。PBS(-) を破棄し、0.5 mL/ウェル解離酵素を追加します。セルを下から切断まで ~ 4 分の CO2インキュベーター (37 ° C) で細胞培養皿を配置します。単一細胞懸濁液を上下に優しくピペットで移しなさい細胞。 による単一細胞懸濁液を 20 mL の prewarmed 4i 完全培地に転送します。常温で 8 分間 300 x g 細胞懸濁液を遠心します。 上澄みを廃棄し、5 mL prewarmed 4i 完全培地で細胞ペレットを再懸濁します。 細胞凝集塊を削除するセルこし器 (40 μ m 孔サイズ) を通って細胞懸濁液をフィルターします。1 mL prewarmed 4i 完全培地で 3 回洗浄セル型ストレーナです。コールター カウンターを使用してセルをカウントします。 4i 素朴な hiPSCs 9 mL prewarmed 4i 完全培地に 10 の6セル × 27.0 32.4 に単一細胞懸濁液を希釈します。その 4i 完全培地には既に Y27632 が含まれています注意してください。 4i トライ ガス インキュベーター (2.4.3.9) からも 8 で完全培地 1 mL を含むマイクロウェル プレートを取る。各ウェルに 1 mL 4i 世間知らずによる懸濁液 (106細胞/ウェル x 3.0-3.6) を接種します。この細胞の密度が重要です。セルが軽くピペッティングして均等に各ウェルに分布していることを確認します。 3 分間 100 × g、室温でマイクロウェル プレートを遠心します。 三ガス CO2インキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) でマイクロウェル プレートを配置します。細胞マイクロウェルのペレットが不可でした。24-30 時間インキュベートする細胞。一晩インキュベート (~ 16 時間) は通常タイトな EBs の形成の不十分であります。 揺動培養 (6 日) の低接着プレートに EBs の転送 次の通り (日 6 – 13 日) hPGCLC 完全培地 50 mL 遠心管中を準備します。20 mL hPGCLC 基礎培地、4 μ L 500 mM 2-メルカプトエタノール、L-アスコルビン酸を 20 mg/mL の 50 μ L、100 μ g/mL の 50 mM Y27632、50 μ L の 4 μ L の組換えの人間 BMP4、500 μ g/mL の 4 μ L 人間 SCF、250 μ g/mL 人間 EGF の 4 μ L、と 250 μ g/mL の 8 μ L ヒト LIF。注: 使用の直前に新鮮な hPGCLC 完全培地を準備し、光への暴露を避けます。完全な hPGCLC を格納しないでください 4 ° C で中程度または一晩冷凍以上。注: BMP4 の濃度が非常に高いです。BMP4 のバッチ間最適 BMP4 濃度が異なる場合があります。BMP4 のロットごとに違い強く hPGCLC の生産に影響を与えます。完全な hPGCLC 中 BMP4 のない場合は、hPGCLCs の収量は非常に低い6です。完全な hPGCLC の中で他のサイトカインの重要性は、ハンナ/Surani6によって記述されていた。注: このプロトコルの完全な hPGCLC 中のヒト LIF の最終濃度は 100 ng/mL6,10です。以前に発行された研究、私たちを含めた最終の LIF 濃度は、1 μ g/mL でした。ヒト LIF 試薬の特定の活動のときは > 10,000 単位/μ g (ED50 < 0.1 ng/mL)、100 ng/mL LIF は EBs から hPGCLC の生成をサポートするのに十分な。 EBs を転送します。 Prewarm 5 mL hPGCLC 基礎培地との 20 mL hPGCLC 完全培地 > 37 の ° C の水浴中で 5 分。 50 mL ポリプロピレン円錐管の上に逆さまセル ストレーナーを設け、慎重に。 ピペット、マイクロウェルの各ウェル プレート マイクロウェルから EBs をデタッチする板で非常に穏やか。EBs に組み込まれていないセルを削除するセル ストレーナーを介して各ウェルのすべての内容をフィルター処理します。 洗って EBs prewarmed hPGCLC 基礎培地 1 mL でセル ストレーナーに保持されます。優しく洗ってを繰り返し 5 回。 50 mL の円錐管の上下にあるストレーナーの膜洗浄の EBs が保持されます。セル ストレーナーが新しい管に通常表示されるようセル ストレーナーに新鮮な 50 mL の円錐管を配置します。迅速に新しいチューブとセル ストレーナーを反転します。セル ストレーナーとチューブが通常の位置で、EBs のとおりセル ストレーナーの膜。 こし器細胞の膜上から 18 mL prewarmed hPGCLC 完全培地を追加することによって円錐管に EBs を収集します。したがって、媒体は、膜を通過し、遠心管の底に膜の下側に取り付けられた EBs を収集します。 低添付ファイル 6 ウェル プレート (3 mL/井戸) の井戸に EBs の板停止。 三ガスのインキュベーター (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) でシーソー移動ロッカーに低取り付けプレートを配置します。〜 20 分につきで揺動の速度を設定します。注: ため旋回運動は適用されません井戸とヒューズのセンターで EBs 集計。慎重に EBs が集約されていないように揺動速度を調整します。あまりにも積極的な揺動と、EBs が物理的に損傷します。注: 低酸素分圧は EB 文化を強く推奨します。 EBs (日 7 – 13 日) の表面に hPGCLCs の生成 新鮮な毎日 20 mL hPGCLC 完全培地を準備します。揺動なし EBs が ~ 1 分削除古い媒体 (~0.2 mL/よく古い媒体が残ることがあります) 乾燥 EBs なしで井戸の底に沈みし、(3 mL/も) 毎日新鮮な hPGCLC 完全培地を追加。 3. 免疫組織化学的染色 EBs (日 10-13 日) ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 免疫染色の細胞外マトリックス蛋白質のブロックに EBs を埋め込む OCT4 として hPGCLCs を識別するために+セル、1.5 mL 低バインド微量遠心チューブに EBs を収穫します。EBs の底に沈むまたは簡潔に (2 秒) を室温で遠心し、媒体を廃棄しましょう。冷たい PBS(-) の EBs をすすいでください。 PBS(-) を外し、冷たい 1%(w/v) アジ化ナトリウムの PBS(-) で氷の上 5 分の 1 mL に EBs を孵化させなさい。EBs の底に沈むまたは簡潔に (2 秒) を室温で遠心分離機をしましょう。、上澄みを廃棄し、冷たい PBS(-) の EBs をすすいでください。注: アジ化ナトリウム添加は細胞内のタンパク質や RNA 転写産物の分解を遅くなります。 氷の上の細胞外マトリックス蛋白質の 200 μ L を解凍し、EBs を含む遠心チューブに追加。ゲルが固化するまでは、〜 10 分の室温でチューブを残します。 PBS(-) で 4% のホルムアルデヒドの 1 mL を追加し、穏やかな揺動を 15 分間室温でインキュベートします。注: 両方 EBs と細胞外のマトリックス蛋白質はこのステップの間に固定します。固定せずゲルのブロックは、脱水の過程で分解可能性があります。固定済み EBs はゲルのブロックに埋め込まれている場合 EBs はゲルのブロックで再び固定されており、過剰固定することができます。 ホルムアルデヒドを破棄し、冷えた PBS(-) を一度 EBs をすすいでください。70% エタノール 1 mL を加えます。ゲル包埋 EBs は、1 週間の 4 ° C で 70% エタノールに格納できます。 FFPE の標準プロトコルとゲル包埋 EBs を処理します。5 μ m の厚さ FFPE スライドを準備します。スライドを一晩乾燥し、免疫染色まで室温で保存ができます。注: 我々 のルーチンの FFPE のプロトコルのとおりです: 70% のエタノール、2 つの変更は、1 時間ごと。80% エタノール, 1 つの変更は、1 時間です。95% エタノール, 1 つの変更は、1 時間です。100% エタノール, 3 つの変更、1.5 時間ごと。キシレン、3 つの変更、1.5 時間ごと。パラフィン ワックス (58-60 ° C)、2 つの変更、2 時間。ステータス退避済みの組織、パラフィン ブロックに埋め込まれ、3-10 μ m (通常 5 μ m) でカットします。 染色の完全に少なくとも 30 分 Deparaffinize 56 ° C のオーブンでスライドを乾燥、キシレンと傾斜アルコール シリーズ スライドをメタンハイド レートします。スライドを 5 分間水道水で洗います。 内因性ペルオキシダーゼを不活化できる、10 分間室温で BLOXALL ブロック ソリューションで水分を補給されたスライドをインキュベートします。PBS で 5 分用のスライドを洗います。 ブロックは正常馬血清 (または他の種の二次抗体の正常血清中) で 20 分間室温でスライドします。 一晩で 4 ° C と PBS(-) 0.1 %bsa 希釈反-OCT-3/4 ヤギ一次抗体とスライドを孵化させなさい (各一次抗体の希釈と培養条件の最適化)。室温、5 分で 3 回 PBS(-) とスライドを洗います。 (馬によって生成された西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体; 参照テーブルの材料) の反やぎ IgG とスライドを 30 分間室温でインキュベートします。室温、5 分で 3 回 PBS(-) とスライドを洗います。 使用直前に必要な量の基板 (材料の表を参照) を染色 DAB をミックスし、完全な DAB 染色常温 5 分の倒立顕微鏡を使用してモニター DAB 染色液でスライドを孵化させなさい反作用を停止とき OCT4+セルに流れる水道水のスライドをすばやく洗浄によって視覚化されます。 アルコール、キシレン一連の階級を持つスライドを脱水します。スライドは、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの準備ができています。メディアをマウントを使用して永続的な FFPE スライドを準備 (材料の表を参照してください) 高解像度の顕微鏡観察のため。 4. FACS EBs (日 10-13 日) から hPGCLCs の濃縮 胚様体解離ボディキットの準備酵素ミックス バッファー X と渦の 1,900 μ L に酵素 50 μ L を追加することによって酵素ミックス 1 を準備します。15 分の 37 ° C の水浴中酵素ミックス 1 を prewarm します。 酵素ミックス 2 を準備するには、20 μ L バッファー Y に 10 μ L の酵素 A を追加します。 完全な EB 解離酵素ミックスを準備する酵素ミックス 1 と 2 を混ぜます。 EBs の解離 低接着プレートから 15 mL 遠心管中の部屋の温度、300 x g で 2 分間遠心する収穫 EBs 上澄みを廃棄、10 ml PBS(-) EBs を再懸濁します。再度遠心分離します。 上澄みを廃棄し、完全な EB 解離酵素ミックス (4.1.3) と EBs を再懸濁します。EBs が分離されるまでは、15 〜 20 分の 37 ° C の水浴の EB を懸濁液を孵化させなさい。培養ピペット EBs 解離を容易にする 3-5 分毎に穏やかにまた、胚様体体解離プログラムで自動発生器を使用します。 解離 EB 細胞懸濁液を 8 mL の冷たい PBS(-) を追加します。40 μ m 携帯こし器を通って細胞懸濁液をフィルターします。1 mL で洗浄セル ストレーナー冷たい PBS(-) 3 回します。 コールター カウンターを使用してフィルターが適用されたセル中断のセルをカウントします。 4 ° c、8 分の 300 x g の細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。10 ml の冷たい PBS(-) 細胞ペレットを再懸濁します。 2 つの管、いいえ染色コントロール (10 ~5セル) の 1 つで (すべての残りのセル) を染色抗 CD38 の他に細胞懸濁液を分割します。 4 ° C、8 分の 300 x g で 2 つの管を遠心します。 抗 CD38 染色と hPGCLCs の FACS 濃縮 PBS(-) では、200 μ L 冷たい 3% (w/v) BSA のコントロールのない染色の細胞ペレットとアジ化ナトリウム 1% (w/v) を再懸濁します。フローサイトメトリーまで氷の上を配置します。注: アジ化ナトリウム添加は、細胞表層の CD38 の内面化を遅くなります。 抗 CD38 冷たい 3% (w/v) BSA と 1% (w/v) におけるアジ化ナトリウム PBS(-) 100 μ L あたり 1 x 106細胞に染色の細胞ペレットを再懸濁します。 FACS 級、APC 標識抗 CD38 抗体の 1 x 10 の6セルあたり 10 μ L を追加します。光への暴露を避けるためにアルミ箔でチューブをカバーします。穏やかな揺動と 45 分のための 4 ° C で孵化させなさい。 5 mL を加えて 300 x g で 8 分間破棄上清および再懸濁します細胞ペレット 5 mL の冷たい PBS(-)、4 ° C で遠心分離機、冷たい PBS(-)。合計で 3 回の PBS(-) で洗浄を繰り返します。 FACS のため十分な細胞密度に PBS(-) で 500 μ L 1% (w/v) と冷たい 3% (w/v) BSA のアジ化ナトリウムと細胞ペレットを再懸濁します。 CD38 として hPGCLCs を豊かに+細胞は、通常明確に区別細胞集団を形成します。いいえ染色コントロールを使用して、CD38 の id を確認する+細胞。HPGCLCs の典型的な収量は一日 10 EBs から、FACS 検討の単一セルの 1-5% と一日 13 EBs からの 20-40%。