Generation von menschlichen Ur Keimzelle-wie Zellen an der Oberfläche der Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen
Summary
Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer von Spermien und Eizellen. Menschliche embryonale PGCs sind aus pluripotenten Epiblast Zellen durch Interaktionen von Zytokinen angegeben. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll des Verursachens von menschlichen Zellen Transcriptomally ähnlich PGCs an der Oberfläche des Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen.
Abstract
Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer aller Zellen der Keimbahn. In Mausembryonen eine Gründerpopulation von ~ 40 PGCs aus pluripotenten Zellen Epiblast durch orchestrierte Forderungen an Zytokinen, einschließlich Knochen morphogenetische Protein 4 (Bmp4) hervorgerufen. In menschlicher Embryonen die frühesten PGCs endodermische Wandmontage von Dottersack gegen Ende der Woche der Schwangerschaft 3rd identifiziert worden, aber wenig bekannt über den Prozess der menschlichen PGC-Spezifikation und ihrer frühen Entwicklung. Um die technischen und ethischen Schranken des Studiums menschlichen embryonalen PGCs zu umgehen, wurden vor kurzem Surrogat Zellmodelle Kultur aus pluripotenten Stammzellen generiert. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll für robuste Herstellung von menschlichen Zellen in PGC-Like (hPGCLCs). Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) in den grundiert Pluripotenz Zustand gepflegt sind die 4i-naiven Neuprogrammierung Medium für 48 Stunden inkubiert, getrennt für einzelne Zellen und in Mikrovertiefungen verpackt. Verlängerte Wartung des HiPSCs im naiven Pluripotenz Zustand verursacht erhebliche Chromosomenaberrationen und sollte vermieden werden. HiPSCs in Mikrovertiefungen bestehen für weitere 24 Stunden 4i Mittel-bis Form Embryoid Körper (EBs), die dann in niedrig-Einhaltung Plasticware unter einer rockigen Bedingung mittelfristig hPGCLC Induktion, enthält eine hohe Konzentration von kultiviert rekombinante menschliche BMP4. EBs sind weiter kultiviert, für bis zu 8 Tage im Schaukelstuhl, nicht anhaftende Zustand, maximale Erträge des hPGCLCs zu erhalten. Von Immunohistochemistry sind hPGCLCs ohne weiteres als Zellen stark ausdrücken OCT4 in fast alle EBs ausschließlich auf ihrer Oberfläche erkannt. Bei der EBs sind enzymatisch dissoziiert und FACS Bereicherung ausgesetzt, können hPGCLCs gesammelt werden, als CD38 + Zellen mit bis zu 40-45 % Ausbeute.
Introduction
Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer aller Zellen der Keimbahn bei beiden Geschlechtern. Größte Teil unseres Wissens über Entwicklung von PGCs in Säugetier-Embryonen erzielt wurde, durch das Studium Labor Mäuse1,2. Im embryonalen Tag 6,0-6,5 von Mäuseembryonen befinden sich 6 oder ähnliche kleine Anzahl von PGC Vorstufen in der Epiblast und eine Gründerpopulation von ~ 40, die PGCs von ihnen in gewissem Sinne abhängig von Knochen morphogenetische Proteine Bmp2 und Bmp4 abgesondert vom angrenzenden induziert werden Zellen. Die frühesten menschlichen PGCs bisher in Embryonen identifiziert wurden an der endodermische Wand der Dottersack am Ende der dritten Woche der Schwangerschaft3. Weil dies am gleichen Ort wie Migration von PGCs in Mausembryonen eingehalten werden, ist es wahrscheinlich, dass die beobachteten menschliche PGCs auf dem Weg der Migration aber nicht die Gründerpopulation waren. Studien Rückverfolgung von früheren Stadien von PGCs oder PGC Vorstufen in menschlicher Embryonen haben gefehlt.
Zugang zu menschlichen embryonalen PGCs ist durch technische und ethische Hindernisse anspruchsvoll. Um diese Hürden zu überwinden, wurden vor kurzem PGC-ähnlichen Kultur Zellmodelle aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (EAP) generiert. Pluripotenz ist die zelluläre Funktion in die Keimbahn und drei embryonalen Mikrobeschichten4zu unterscheiden. Während menschliche PSCs Mittel-und mTeSR1 (ein Ready-to-Use, im Handel erhältlichen Mittel, die für die Aufrechterhaltung der menschlichen EAP im grundiert Pluripotenz Zustand formuliert) auf Gerichte mit der extrazellulären Matrix Protein beschichtet gepflegt haben grundiert Zustand Pluripotenz 4, 2013 Jacob Hanna Labor zeigte, dass die grundierte Pluripotenz Zellen in einem naiven Pluripotenz Zustand durch belichten die naive menschliche Stammzellen (NHSM)-haltigem Medium chemische Inhibitoren, Proteinkinasen ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, umgewandelt werden können p38 MAPK sowie Wachstumsfaktoren LIF, TGF, bFGF5. Aus naiv-Pluripotenz menschlichen EAP im Jahr 2015 erreicht eine Forschungsgruppe unter der Leitung von Hanna und Azim Surani die erste robuste Produktion menschlicher PGC-Like Zellen (hPGCLCs) von EAP-6. Mehrere andere Labors, einschließlich der unsrigen, berichtete später, Generierung von hPGCLCs aus einheitlichen Ansprechpartner mit leicht unterschiedlichen Protokollen7,8,9,10. Unserer Studie haben nachgewiesen, dass hPGCLCs über verschiedene Protokolle (die in Tabelle S1 unserer bisher veröffentlichten Studie10zusammengefasst sind) erzeugt Transcriptomally einander10ähnlich sind. Verfügbaren Beweise unterstützt die Ähnlichkeit des menschlichen PGCLCs, frühe menschliche embryonale PGCs vor der globalen epigenetische Löschung7 und/oder chemotaktische Migration10.
Studien der Maus embryonalen PGCs, Maus PGCLCs und menschlichen PGCLCs (aber nur sehr begrenzten Zugang zu menschlichen PGCs) haben gezeigt, dass die molekulare Mechanismen der PGC Spezifikation unterscheiden sich erheblich zwischen Maus und Mensch1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Z. B. Prdm14 spielt entscheidende Rolle bei PGC-Spezifikation in Mausembryonen, aber seine Rolle bei der menschlichen PGC Spezifikation scheint begrenzt1,15. Im Gegensatz dazu unbedingt Induktion von SOX17 durch EOMESODERMIN PGC Spezifikation6,11,14, während diese Transkriptionsfaktoren für Maus PGC Spezifikation15entbehrlich scheinen. Diese ersten Ergebnisse von Studien mit hPGCLCs stark unterstützen die Bedeutung dieses Handy-Kultur-Modells als Surrogat der menschlichen embryonalen PGCs.
Kürzlich veröffentlichte Studien, mit unserem Labor Tiefe Sequenzierung Bewertung der genomischen DNA-Kopie Zahlenanalyse, haben gezeigt, dass längere Wartung der einheitlichen Ansprechpartner in der naiven Pluripotenz Zustand deutlich das Risiko von chromosomale Instabilität erhöht und strukturelle Anomalien. Dieses Phänomen wurde mit Maus18 und menschlichen19 PSCs beobachtet. Das ursprüngliche hPGCLC-Produktion-Protokoll von Hanna/Surani berichtet wurde für menschliche PSCs gepflegt im 4i naiv Pluripotenz Medium für mindestens 2 Wochen6entwickelt. Um die normalen diploiden Karyotyp der menschlichen PSCs und PGCLCs zu bewahren, entwickelten wir ein modifiziertes Protokoll in der menschlichen PSCs 4i Medium für nur 72 Stunden10, ausgesetzt werden, die in diesem Artikel vorgestellt werden. Menschlichen iPSCs (HiPSCs) sind unter den grundiert Pluripotenz Zustand beibehalten. Unmittelbar vor der EB Bildung sind Zellen mittelfristig 4i naiv Neuprogrammierung (veränderter NHSM Medium) für 48 Stunden inkubiert. Zellen werden dann getrennt und in Mikrovertiefungen Form EBs für weitere 24 Stunden im 4i Medium verpackt. EBs bestehen in hPGCLC Induktion Medium mit einer hohen Konzentration von rekombinanten menschlichen BMP4 unter einer rockigen Bedingung für keine-Anlage Kultur für bis zu 8 Tage, die maximale Ausbeute an hPGCLCs zu erhalten. Nach 8 Tagen EB Kultur können hPGCLCs von dissoziierten EB Zellen durch FACS isoliert werden, wie in FACS-sortierbare einzelne Zellsuspension CD38 + Zellen mit bis zu ~ 40 % Ausbeute. Während andere veröffentlicht Methoden7,8,9, einschließlich das ursprüngliche Protokoll vor unsere Änderungen6, in der Regel generieren hPGCLCs in spontan gebildeten Zelle Aggregate ohne ausdrückliche Lokalisierung, hPGCLC produziert von unserem Protokoll an der Oberfläche des Embryoid Körper (EBs) eingehalten werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Robuste Herstellung von hPGCLCs mit dem beschriebenen Protokoll hier wurde mit drei unabhängigen Klonen von menschlichen iPSCs mit dem normalen diploiden Karyotyp10bestätigt. Diese iPSC-Klone wurden von der gleichen Menschenhaut neonatale dermalen Fibroblasten Zelle Kultur10abgeleitet. Sie werden von Autoren dieses Artikels an die Ermittler auf Anfrage und unter geeigneten Materialien Übernahmevertrag und Versand Anordnung der gefrorenen lebenden menschlichen Zellen bereitgestellt werden. Es ist derzeit unklar, ob die normalen Karyotyp erforderlich für robuste hPGCLC Produktion mit unserem Protokoll oder solche von anderen Labors gemeldet ist.
Neuere Studien haben gezeigt, dass Produktion von hPGCLCs aus HiPSCs11 oder WSR14 mit einem Protokoll von Saitou Gruppe der Universität Kyoto8 beschrieben abhängig von Ausdruck des EOMESODERMIN, erforderlich für ein Transkriptionsfaktor, der T-box Induktion von SOX17. SOX17 scheint zu funktionieren, als der Meister Linie Transkription Faktor in Differenzierung der Keimbahn des menschlichen pluripotenten Stammzellen6. EOMESODERMIN wird durch das EOMES -Gen kodiert und CRISPR/Cas9 KO von EOMES verursacht fast völlige Fehlen von SOX17 Induktion in den hPGCLC Zustand11produziert Expression anderer Gene folgte dem gleichen Muster von der SOX17-Null-Knockout-Zellen. Überexpression des EOMESODERMIN aus einem induzierbaren Vektor in EOMES-null Ko Zellen während hPGCLC Induktion Kultur effizient gerettet, der robuste hPGCLC Produktion sowie die Induktion der Keimbahn Gene, einschließlich SOX17. Induzierte Überexpression SOX17 gerettet dagegen auch die robuste PGCLC-Produktion, aber ohne EOMES induzieren. So, EOMESODERMIN ist eine kritische vorgelagerten Induktor von SOX17, und dies scheint die einzelne wichtigste Rolle von EOMESODERMIN in hPGCLC Induktion aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Unser Protokoll induziert SOX17 in HiPSCs10, aber seine Abhängigkeit auf EOMESODERMINE Induktion erwartet noch nicht festgelegt.
Dieses Protokoll konvertiert grundiert Pluripotenz menschlichen iPSCs ERK-unabhängige naiv Pluripotenz Mittel-und mTeSR1 für 96 Stunden in der 4i Umprogrammierung mittlere6, das ist eine veränderte naiv humanen Stammzellen Medium (NHSM)5beibehalten. Unsere Versuche, hPGCLCs, beginnend mit der gleichen menschlichen iPSC-Klone aber in anderen handelsüblichen menschlichen iPSC Wachstumsmedien gepflegt, bevor Kultur in der 4i Umprogrammierung Medium in unterschiedlichem Maße von niedrigeren hPGCLC Erträge führte zu generieren. Obwohl ob längerfristige Anpassung in anderen Medien hPGCLC Produktion verbessert oder nicht bleibt in zukünftigen Studien ermittelt werden, diese Beobachtung legt nahe, dass den genauen Zustand des grundiert Pluripotenz von menschlichen iPSCs vor der 4i Umprogrammierung deutlich wirkt sich EB Bildung 4i Mittel- und EB Differenzierung in hPGCLC Medium.
Herstellung von hPGCLCs aus HiPSCs nach unserem Protokoll ist robust und hoch reproduzierbare, teilweise bedingt durch die Verwendung der Microwell-Platten, die effiziente Produktion von eine große Anzahl von EBs zu ermöglichen (~ 8.000 EBs pro Charge) mit einer einheitlichen Größe (3.000 HiPSCs pro EB). Die Anzahl der EBs leicht produziert in einem einzelnen Batch Experiment mit unserem Protokoll möglicherweise weit größer als Methoden mit den regelmäßigen U-Boden Zelle Kultur Brunnen. Produktion von eine große Anzahl von gleich großen EBs gleichmäßig mit hPGCLCs übersät kann bieten einzigartige Möglichkeiten der Hochdurchsatz-chemischen Vorführungen, kleine Molekulargewicht Aktivatoren oder Inhibitoren beeinflussen PGC-Spezifikation zu identifizieren oder ihre biologische Eigenschaften wie epigenetischen Reprogrammierung. Solchen EBs kann auch für die toxikologische Beurteilung einer großen Zahl von Keimbahn Zelle Giftstoffe, einschließlich nicht nur Umwelt-Schadstoffe, sondern auch klinisch verschriebene Medikamente wie z. B. Chemotherapeutika nützlich.
Die entscheidenden Faktoren der stabile und reproduzierbare Produktion von hPGCLCs mit dem vorgestellten Protokoll enthalten (i) die Verwendung von gesunden HiPSCs in mTeSR1 auf extrazelluläre Matrix Protein, (Ii) die genaue Anzahl der Zellen wie angegeben und streng impfen gepflegt Befolgen Sie die Anzeigedauer der mittlere Veränderung und Subkultur, (Iii) viel menschliche recombinant BMP4 und (iv) körperliche Schäden von EBs während der rockigen Kultur zu minimieren auswählen. Es ist unsere Erfahrung, die das beste vieler BMP4 Reagenz bei 100 ng/mL Konzentration gearbeitet, während andere viel BMP4 Reagenzien 2 X oder höhere Dosen erforderlich. Auf der anderen Seite, Ausbeute an hPGCLCs Produktion mit die beste Menge BMP4 eher, bei höheren Dosen von BMP4 zurückgegangen (z. B. 200 ng/mL). Es wird empfohlen, mehrere verschiedene Lose von rekombinanten menschlichen BMP4 Reagenzien erhalten von verschiedenen Anbietern für ihre Leistung bei der Unterstützung der hPGCLC Generation zu testen und um eine große Menge der besten Partie zu sichern.
Eine Besonderheit unseres hPGCLC-Protokolls ist, dass hPGCLCs auf die äußerste Oberflächenschicht der EBs10 (Abbildung 8), lokalisiert sind, während andere Protokolle hPGCLCs in der Mitte der Zelle Aggregate6,8erzeugen können. Embryoid Körper sind in der Regel mehrere unterschiedliche Schichten wie Oberfläche, Außenschale, Innenschale und Kern zu bilden, und die zentralen Kern-Regionen sind oft nekrotische aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Nährstoffen, Sauerstoff, sowie Pro-Überlebenden Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt Form der Kultur Mediums durch Diffusion20. Lokalisierung von hPGCLCs auf der Oberfläche der EBs ohne mögliche Einschränkungen aufgrund der begrenzten Verbreitung in Richtung der Mitte der EBs möglicherweise vorteilhaft für direkte, zeitgesteuert und Dosis Exposition von hPGCLCs auf Medikamente oder giftige Substanzen für pharmakologische oder toxikologische Studien.
Während Steuern Maus PGCLCs zeigen robuste genomweite DNA Demethylierung unter Einbeziehung der Prägung Regionen zumindest teilweise scheint7,19,20, der Grad der globalen gDNA Demethylierung in hPGCLCs schwächer als Maus PGCLCS oder PGCs6,7. Transcriptomal Profile legen nahe, dass hPGCLCs in einem früheren Stadium der embryonalen PGCs als Maus PGCLCs10ähneln kann. Es wurde berichtet, dass längere Kultur der EBs unter der Bedingung der hPGCLC Produktion ein erhöhtes Maß an gDNA Demethylierung7verursacht; ob eine längere Kultur der hPGCLCs in EBs oder als isolierte Zellen mehr fortgeschrittene Stadien der Keimbahn Differenzierung erreichen müssen jedoch durch zukünftige Studien bestimmt werden.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen Shiomi Yawata und Chie Owa für technische Hilfe während der anfänglichen Studien. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des NIEHS/NIH R01 ES023316 und R21ES024861, TS und durch Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) Zuschuss an JHH unterstützt.
Materials
| Primed pluripotency hiPSC culture | |||
| Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
| Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4i hiPSC culture | |||
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
| human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
| human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| 4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
| PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
| BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hPGCLC culture | |||
| Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
| Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
| Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
| Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
| Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
| 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
| Low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemical staining | |||
| BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
| Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
| OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
| ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
| Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolating hPGCLC | |||
| Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
| Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |
References
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