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Bio-ingénierie

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

Published: October 17, 2018
doi:
10.3791/58293
, , , , , , , , ,
1The Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research,Penn State College of Medicine, 2Division of Experimental Pathology, Department of Pathology,Penn State College of Medicine, 3Medical Scientist Training Program,Penn State College of Medicine, 4Center for In Vivo Microscopy,Duke University Medical Center, 5KTM Research

Summary

우리는 프로토콜을 개발 하 고 밀리미터 규모 표본의 포함 수 있도록 사용자 지정 장치를 설계. 우리는 아크릴 수 지와 폴 마이크로-코네티컷에 의해 경직 된 동원 정지 및 조직 구조와 세포 형태학의 심문에 대 한 표본의 장기 저장을 달성 하기 위해 튜브에 포함에 중점을 두고 샘플 준비 절차를 제시

Abstract

한 백 년 이상에 대 한 조직의 조직학 연구가 되었습니다 의료 진단에 대 한 황금 표준 조직학 발견 하 여 특징 모든 조직에 모든 셀 형식을 허용 하기 때문에. 본 연구실은 x 선 마이크로-단층 촬영 (마이크로 CT) 셀룰러 해상도에서 전체 조직 볼륨의 연구 조직학의 진단 능력을 가져올 것입니다에서 기술 진보를 만들기 위해 적극적으로 노력 (즉,., x-레이 Histo-tomography 양식 적임). 이 끝으로, 샘플 준비 파이프라인을 대상으로 개선을 했습니다. 하나의 중요 한 최적화, 그리고 현재 작업의 초점 고정 및 스테인드 밀리미터 규모 샘플의 엄밀한 포함을 위한 간단한 방법입니다. 샘플 immobilization와 상호 마이크로 CT 영상에 대 한 게시 된 방법의 많은 파라핀 왁 스, agarose, 또는 알코올 등 액체 샘플을 두기에 의존. 우리의 접근 방식을 사용자 지정 절차와 기구의 3 차원 인쇄 튜브, 폴에 직접 아크릴 수 지에는 샘플을 포함 하는 엑스레이에 상대적으로 투명 한 디자인으로이 작품을 확장 합니다. 여기, 샘플 준비 절차 전체 zebrafish 애벌레 그리고 청소년, 또는 다른 동물에 대 한 적합 한 직경 10 m m 0.5에서 샘플 및 비슷한 크기의 조직 샘플에 대 한 설명 합니다. 개념의 증거로 우리 Danio, 초파리, 벼룩, 그리고 마우스 배아;에서 표본을 포함 이 샘플의 3에 대 한 3 차원 검사에서 대표 이미지 표시 됩니다. 중요 한 것은, 우리의 방법론 엄밀한 immobilization, 힘들게 만든 자원의 장기 보존, 다시 샘플을 검사 하는 기능 등 여러 혜택을 리드.

Introduction

고기는 유전 배경 및 환경 사이의 독특한 상호 작용의 결과 나타내는 유 기체의 현저한 특성. 이러한 특성은 행동, 생화학, 형태학, 발달, 또는 생리 적 속성을 포함할 수 있습니다. 중요 한 것은, 야생-타입 생물과 유전자 돌연변이 간의 특성 차이 메커니즘 및 영향을 받는 유전자의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 형태학에 관하여 histopathology 세포 수준에서 고기를 평가 하기 위한 황금 표준 하지만 기계적 유물에서 앓고 이며 정확한 양적 volumetric 분석1을 허용 하지 않습니다. 우리의 실험실은 서브 마이크론 해상도에서 전체 조직 볼륨에 조직학의 진단 능력의 응용 프로그램에 장벽을 극복 하기 위해 동기 이다.

사용 가능한 기술 조사는 x-레이로 이미징 마이크로-계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT) 밀리미터 규모 전체 동물의 3 차원 (3D) 조직학에 필요한 이상적인 기능을 제공할 수 있습니다 제안 합니다. 마이크로-CT 비-파괴, 등방성, 3D 시각화와 조직 아키텍처1,2의 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 마이크로-CT에 의해 흠 없는 및 금속 스테인드 zebrafish의 3D 이미징 증가 견인을 얻고 있다 고 volumetric 여러 조직, 근육, 치아, 뼈, 및 지방 조직3,4 등의 분석을 위해 활용 하 고 있다 ,5,6,7,8,,910. 다른 모형 유기 체 및 조직 표본 마이크로 CT 영상 의무가 있습니다. 예를 들어, 파이프라인 마우스 두뇌 통해 싱크 로트 론 마이크로-CT11군데의 밀도 mesoscale neuroanatomy 측정에 대 한 도입 되었습니다. 마찬가지로, 오신 기반 얼룩 프로토콜 전체 마우스 장기12의 부드러운 조직 마이크로-CT 영상에 적합 하도록 표시 되었습니다. 흠 없는 인간의 L3 척추의 형태학 분석 및 마이크로 CT를 사용 하 여 실버 얼룩진 인간의 폐의 시각화는 인간을 위한이 기술의 유틸리티 샘플13,14증명 하고있다.

그대로 작은 동물 및 조직 표본의 완전 한 형태학 적 형질에 대 한 마이크로-CT의 위대한 약속을 실현 하기 위해 다양 한 장애물 처리량, 해상도, 보기의 필드, 얼룩, 포괄적인 셀에 관하여 극복 될 필요가 그리고 장기 보존입니다. 각 이러한 측면은 매우 중요 하다, 그러나 현재 원고의 초점은 샘플 고정 및 얼룩에 추가 메모 포함 절차의 최적화 이다. 마이크로-CT 이미지에 다른 부드러운 조직 간의 고유의 대비 낮기 때문에 중 금속 착 색 하는 것은 유용 합니다. 오스뮴 tetroxide, 요오드, phosphotungstic 산 (PTA), gallocyanin-chromalum 등 다양 한 금속 힘 얼룩, 마이크로-CT 영상에 대 한 대비 향상 되었습니다 공부15,,1617. Uranyl 아세테이트는 또한 뼈와 연골18,19의 마이크로-CT 영상에 대 한 대조 대리인으로 사용 되었습니다. 학부모 우리의 프로토콜에 사용 되는 거의 모든 조직의 일관 된 얼룩 리드 되며 전체 zebrafish 표본, 이미지를 양보 셀 잠재적으로 조직의 전체 볼륨을 통해 조직학 같은 연구와 호환.

마이크로-CT 이미지 수집 하는 동안 2 차원 (2D) 프로젝션 샘플 학위의 일부분에 의해 회전으로 이며 샘플 180 ° 또는 360 ° 회전, 2D 프로젝션 사용의 수천의 일련을 생성 완료 될 때까지 반복 합니다 3D 볼륨20의 재건입니다. 이 과정에서 표본의 어떤 섭 동 결과 제대로 복원된 3D 볼륨에 어긋나서 되도록 해당 2D 투영 될 수 있습니다. 샘플 동원 정지는이 문제를 해결 하는 방법 및 일부 현재 전략 포함 알코올에 샘플 물속 또는 폴 리 프로필 렌 튜브 또는 micropipette 팁3,5,15, agarose에 포함 16 , 21 , 22. 액체 침수 메서드는 이상적인 이미지 수집 동안 샘플 운동 영상 세트, 3D 볼륨23의 이동한 개조 결과 간에 발생할 수 있습니다 때문에. 또한, 그것은 잘 알려진 액체 저장 조직 샘플의 물리적 안정성은 화학 불안정성와 표면 마모 관련 샘플 및 컨테이너 벽 (사이 접점의 이동 된 년, 개월의 시간의 척도에 가난한 개인 관측 고정된 동물 및 인간의 조직 샘플).

이미징 동안 샘플 운동에 대 한 가능성을 줄이기 위해, 샘플 agarose24,,2526에 포함 될 수 있지만이 연습 얼룩 agarose 이미지 감소에 확산의 위험과 연관 대비26. 또한, 액체 또는 agarose 준비 물리적 손상 하는 경향이 하 고 그들을 장기 샘플 저장을 위해 부적 한 만드는 시간이 지남에 저하. 우리는 잠재적으로 성공 하 고 간단한 샘플 immobilization 메서드 사용 전자 현미경 표본에서 적응 될 수 있는 것을 권유. EPON 812 (단종 및 대체 포함 812) 등 수 지 생산 일반적으로 경도 전자 현미경,2728ultrathin 섹션을 생성 하는 데 필요한을 제공 하는 데 사용 됩니다. 실제로, x-레이 이미징 및 전자 현미경 사이 여러 비교 연구 수 지에 포함 된 샘플 x 선 현미경29,30여 군데 될 수 있다 설명 했다. 그러나, 일부는 전자 현미경 검사 법의 표준 관행 마이크로-CT 영상에 직접 번역 하지 않습니다. 예를 들어 샘플의 마이크로-CT 영상 제곱 일반적인 수 지 블록의 가장자리에 수 지 이며 샘플 해당 블록에서 잘라 가장자리 회절 아티팩트 이미징 방해할 수 있는 연관. 가능한, 동안 수 지 가장자리를 부드럽게 힘들고 시간이 걸리는입니다.

플라스틱 포함 수 지의 다양 한 전자 현미경에서 채택 된다, 하는 동안 높은 배경 포함 812 같은 더 수 지와 관련 된 다른 테스트를 이끌었다. 우리는 중 합, 그리고 낮은 배경 동안 그것의 낮은 점성, 낮은 수축 량, 낮은 경향이 폼 거품 LR 화이트를 선택 했다. 지 무료 샘플을 생성 하 고 샘플을 둘러싼 수 지의 양을 최소화 하기 위해 우리는 합 전 구체의 튜브에 표본 액체 수 지를 프로토콜을 개발 했다. 튜브의 제거 이미징에 대 한 필요 하지 않습니다 있도록 구체의 그것의 높은 열 안정성과 높은 x 선 투과율에 대 한 선정 되었다. 마지막으로, 우리는 안정적으로 튜브를 잡고 하 고 micropipettes의 오염을 방지 기법을 포함 하는 우리의 샘플에 대 한 사용자 지정 micropipette 어댑터를 설계. 어댑터는 3D CAD 이미지 파일에서 인쇄 될 수 있습니다. 함께 찍은, 여기에 제시 된 샘플 준비 방법의 목표는 포함의 작은 샘플 더 간단 하 게, 달성 하기 얼룩, 엄밀한 immobilization, 명암과 그대로 밀리미터 규모 표본의 장기 저장 향상 된입니다.

Protocol

살아있는 동물에 대 한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 펜실베니아 주립 대학에 의해 승인 되었다. 1. 주 1: 고정 개선 하는 고정 고 본질적인 내용의 볼륨을 줄이기 위해, 적어도 24 h 10 mm 표본에 대 한 또는 더 큰 표본에 대 한 더 이상 청소년 물고기를 굶 어 (예., 14 mm 표본에 대 한 72 h). 미리 진정 10% 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF)와 2 x 4 ° c 얼음에 Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) 물고기 두 번 물 냉 2 볼륨 신속 하 고 자비 롭 안락사에 대 한 MS-222 x. 기다리는 30 60 s (애벌레) s (청소년) 물고기 후 이동 중지. 냉장된 10%에서 생선을 담가 NBF 10 분. 하룻밤 실 온에서 플랫 컨테이너에서에서 냉장된 10 %NBF 솔루션에 물고기를 수정.참고: 플랫 컨테이너는 시료의 굴곡을 최소화 하기 위해 필요 합니다. 별도로 지정 하지 않는 한 정착 액의 볼륨 및 모든 후속 단계 솔루션 20 배 이상 샘플 볼륨을 이어야 한다. 1-5 애벌레 zebrafish, 권장된 솔루션 볼륨 1 mL 이상입니다. 부족 한 통 결과 가난한 고정와 시 약 볼륨의 잉여 않습니다 하지 부정적인 영향 설명된 하는 절차의 결과. 큰 물고기의 완전 한 정착, 항문 기 공 앞쪽 약간 시작 하는 배를 쨌 다. 가 위 또는 칼의 최소한의 침투를 사용 하 고 내부 장기에 손상을 최소화 하기 위해 절단 하는 동안 물고기에서 부드러운 힘을 적용. 기정 프로토콜 되었습니다31,,3233다른 사람에 의해 설명. 2. 주 2: 탈수 & 얼룩 1 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) pH 7.4 10 분 x 3 회 고정된 표본 린스. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 20 분 동안 35% 에틸 알코올 (EtOH)에서 샘플을 잠수함.참고: 모든 부드러운 동요 단계 탁상 통 사용 하 고 신중 하 게 지원 해주과 컨테이너 표면에 대 한 샘플의 마찰을 피하고 있는 동안 혼합 효과 대 한 설정 합니다. 50%에서 샘플 잠수함 EtOH 부드러운 동요와 함께 실 온에서 20 분. Phosphotungstic 산 (PTA) 분말 1 %w / v 재고 솔루션을 준비 하는 물에 용 해. 희석 1% 학부모 재고 솔루션 3: 7에서 100% EtOH 0.3% 학부모 얼룩 솔루션을 얻을. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 0.3% 학부모 솔루션에 하룻밤 샘플 얼룩. 3. 주 3: 침투 100 %EtOH LR 화이트 아크릴 수 지의 v/v를 1:1 혼합물을 준비 하 고 따로 설정 합니다. 70%에 3 번 린스 EtOH 10 분. 90%에서 샘플 잠수함 EtOH 부드러운 동요와 함께 실 온에서 30 분. 95%에서 샘플 잠수함 EtOH 부드러운 동요와 함께 실 온에서 30 분. 100%에 (서) 두번 샘플 잠수함 EtOH 부드러운 동요와 함께 실 온에서 30 분. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 하룻밤 1:1 EtOH와 LR 화이트 아크릴 수 지 혼합물에서 샘플 잠수함 4. 주 4: 포함 샘플 100 %LR 화이트 부드러운 동요와 함께 실 온에서 2 h에 대 한 수 지에서는 잠수함 신선한 100 %LR 바꿉니다 단계 4.1에서에서 수 지 수 지 화이트와 부드러운 동요와 함께 실 온에서 1 h에 품 어. 조립 포함 장치 (그림 1). 적절 한 직경 및 길이의 폴 리 이미 드 튜브를 잘라.참고: 적어도 0.1 m m는 시료의 직경 보다 큰 내부 직경 튜브는 것이 좋습니다. 전형적인 표본에 대 한 튜브의 30 m m의 표준 길이 각 샘플에 사용 됩니다. 때, 길쭉한 표본 긴 튜브를 사용 하 여 가질 수 있습니다. P1000 micropipette 포함 어댑터의 넓은 끝에 부착 하 고 좁은 끝 (그림 1C)에 폴 리 이미 드 튜브를 삽입. 포함 어댑터를 사용할 수 없는 경우에 4.3.3 단계로 이동 합니다. 그렇지 않으면, 단계 4.4를 계속 합니다. 바로 같은 구체의 튜브 snugly 맞는 걸쳐 micropipette 팁의 끝 클립. 0.0403″에 대 한 200 µ L 노란색 micropipette 팁의 넓은 끝에서 44 m m 잘라 튜브와 0.105″ 에 대 한 1 mL 블루 팁의 바닥에서 59 mm 튜빙. 필요에 따라 트림. micropipette 컷된 micropipette 팁을 연결 합니다. 작은 무게 보트 또는 V 자형 솔루션 분 지에 샘플을 전송 하 고 완벽 하 게 100%에서 샘플 잠수함 LR 화이트 수 지. 단계 4.3에서 포함 장치 목표 (또는 동물 표본의 경우 머리 쪽으로) 고정된 샘플의 넓은 끝에 튜브와 튜브에는 시료를 천천히 플라스틱. 튜브 중간 샘플 놓고 튜브 위와 아래는 표본 수 지 가득 확인 합니다. 샘플은 자연, 앞으로 방향으로 이동 되도록 샘플 튜브에 플라스틱.참고: 느린 pipetting 기포 및 견본 피해 튜브 가장자리에 마모를 방지 합니다. 튜브에 뒤로 이동 쉽게 사지 (팔 다리, 날개, 지 느 러 미, 등)을 손상 수 있습니다. 그 후, 공기 제거 하는 동안 튜브를 입력 하지 않습니다 포함 장치에 일부 수 지 오버플로 허용 하는 것이 좋습니다. 즉시 부드러운 모델링 유성 점토와 오픈 엔드 인감. 1 m m 두꺼운 시트에 찰 흙을 평평. 색인과 중간 손가락 사이 튜브를 고정 시켜야 합니다. 천천히 손가락으로 튜브의 끝에 대 한 찰 흙을 누릅니다. 초과 찰 흙을 제거 합니다. micropipette에서 포함 장치를 제거 합니다. 부드러운 회전으로 튜빙 당겨 하 고 점토와 다른 쪽 끝을 봉쇄. 흙의 방출 방지 하기 위해 봉인 된 끝에 손가락을 잡으십시오. 천천히 흙에 튜브의 봉인 되지 않은 끝을 밀어. 튜브를 놓고 가로 65 ° c.에 24 h에 대 한 수 지 유해 및참고: 가로 배치 중 합 동안 샘플 움직임을 방지합니다. 만약 공기의 작은 양의 단계 4.8에 갇혀 있었고, 공기 방울이 함께 최종 표본으로 공기 거품의 움직임을 방지 하기 위해 약간 상승 수 있습니다. 중요 한 것은, 중 합 하는 동안 너무 많이 상승이 중력으로 인해 낮은 끝을 견본을 발생할 수 있습니다. 제대로 포함 된 샘플 하나의 공기/수 지 인터페이스에서 굴절 이미지 품질 (그림 2)을 저하 시킬 수 있기 때문에 피해 야 한다 공기 방울이에 비해 표시 됩니다. 5. 제 5 일: 수집 하루 5 월말에 이미지 수집에 대 한 샘플을 수집 합니다.참고: 폴 리 이미 드 튜브의 제거는 가능 하지만 영상에 대 한 필요 하지 않습니다. Zebrafish 샘플에 대 한 마이크로-CT 영상 싱크 로트 론 기반 Beamline 2-BM에 고급 광자 소스 (AP) 아르곤 국립 연구소 (Lemont, 일리노이, 미국)에서 수행 되었다. 학부모 스테인드 zebrafish, 5-30 keV의 최적의 x 선 에너지 범위 결정 했다, 및 13.8의 x 선 에너지 케빈에 사용 된 이미지. 1501 예측 13.8에서 가져온 keV 이상 180도 (1 투영 0.12도 간격) 2048-의해-2048 픽셀 카메라와 함께. 또한, 두 개의 플랫 필드 (이득) 이미지 (처음에)와 수집의 끝에와 한 다크 필드 이미지 또한 취득 했다. 플랫 필드와 다크 필드 교정, 링 아티팩트 감소, 그리고 이미지 재건 끝났다 TomoPy 툴킷34소스 오픈을 사용 하 여. 학부모 스테인드 벼룩 과 초파리 샘플 x 선 현미경12,35에 몇 군데 있었다. 특정 마이크로 CT 설정 개체와 얼룩의 품질에 따라 달라 집니다. 예를 들어 초파리 표본 40 kVp, 74에 스캔 된 mA 및 15 3.10 3.10 × × 3.10 µ m3의 복 셀 해상도에서 s.

Representative Results

프로토콜 전체 zebrafish 애벌레에 대 한 샘플 준비 절차 및 청소년 마이크로 CT 영상에 대 한 내용은 위에서 설명한. 특히,이 메서드는 다른 샘플 형식에 쉽게 적응 (예., 초파리, 벼룩, 애기, 마우스 기관). 보육 시간 다양 한 단계에는 zebrafish 애벌레와 비슷한 크기;의 샘플에 대 한 적절 한 큰 샘플 더 이상 외피를 요구할 수 있습니다. 단계를 포함 하는 샘플을 돕기 위해, 우리는 1 mL micropipette에 부착 하 고 폴 (그림 1) 배관의 다양 한 크기에 대 한 사용자 정의할 수 있습니다 어댑터 설계 되었습니다. 이 사용자 지정 어댑터는 3D CAD 파일에이 원고와 연결 하 고 http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/에서 다운로드할 수 있는 인쇄 했다. 모든 독자는 3D 프린터에 액세스할 수 없을 수 있습니다, 이후 micropipette 팁을 사용 하 여 만든 포함 장치의 프로토콜 (단계 4.3)에 설명 되어 있습니다. 성공적으로 임베디드 zebrafish 애벌레는 이미지 품질 저하 가능성이 것입니다 공기 거품 (그림 2), 표본에 비해 표시 됩니다. 포함 절차의 다양성을 보여, 우리 표시는 표본 다양 한 모형 유기 체에서 (즉,., Danio, 초파리, 벼룩, 마우스 배아)을 샘플 준비 파이프라인 (겪 그림 3)입니다. 전체 Danio, 벼룩, 그리고 초파리 표본 마이크로-CT에 의해 몇 군데의 재건된 3D 볼륨 (그림 4) 표시 됩니다. 중요 한 것은, Danio 샘플에서 설명 된 대로 이러한 표본 시간의 연장된 기간에 대 한 저장 고 여러 이미징 세션 (그림 5)에 대 한 재사용. 그림 1입니다. 장치를 포함. (A) 어댑터는 일반적인 실험실 도구를 사용 하 여 포함을 촉진 하도록 설계 되었습니다. (어댑터의 B)는 단면 그림. (C) 시점 어댑터 (a) 폴 리 이미 드 튜브의 삽입 후 장치를 포함와 micropipette 어댑터 포인트 (c)에 연결. 어댑터 세그먼트 (b)는 오버플로 챔버를 과잉 수 지를 수용 하 고는 micropipette 오염 으로부터 보호 하도록 설계 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2입니다. 기포 없는 성공적으로 포함 된 표본은. (A)는 포함 된 3 일 후 수정 (dpf) 애벌레 zebrafish 기포 없이. (B)는 임베디드 3 dpf zebrafish 공기 방울이 함께. 샘플은 중 합 하는 동안 수평으로 배치 되지 않습니다 경우 공기 포함 하는 과정에서 갇혀 표본으로 이동할 수 있습니다. 스케일 바 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3입니다. 다양 한 표본 우리의 프로토콜 포함 될 수 있습니다. (A) 7 dpf zebrafish 유 충입니다. (B) 성인 초파리. (C) 성인 벼룩 (D) 마우스 배아입니다. 마우스 배아 등 큰 샘플 몇 가지 수정 프로토콜에 의해 수용 된다. 간단히, 구체의 튜브 수 지로 그것의 길이의 1/3 가득 이었고 포함 이전 생산. 고정 및 스테인드 샘플 미리 polymerized 수 지 위에 배치 했다. 튜브 뒤에 두 번째 합 수 하는 해제 polymerized 지 다음으로 채워졌다. 폴 리 이미 드 튜브는이 그림에는 샘플의 더 나은 시각화 수 있도록 사진 전에 제거 되었습니다. 튜브의 제거 마이크로-중부 규모 막대로 성공적인 이미지 수집에 대 한 필요 하지 않습니다: 표본 이미지, 5 밀리미터; 인세트 1. 확대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4. 임베디드 표본 3 차원 렌더링. (A) 재건축 0.743 × 0.743 × 0.743 µ m3 복 셀 해상도 3 dpf zebrafish 유 충. (B) 재건축 성인 벼룩 (3 × 3 × 3 µ m3 복 셀 해상도). (C) 재건축 성인 초파리 (3.1 × 3.1 × 3.1 µ m3 복 셀 해상도). 왼쪽된 열에 표시 된 것 처럼 어떤 각도에서 디지털 횡단면을 생성할 수 있습니다. 표면 렌더링, 오른쪽에 표시 됩니다 상용 소프트웨어를 사용 하 여 렌더링. 수 지를 포함 모든 검사 샘플 외부에서 볼 수 있습니다 (의해 *), 하지만 샘플 자체에 방해가 되지 않습니다. Zebrafish 유 충은 고급 광자 소스 싱크 로트 론 기반 하에 아르곤 국립 연구소에서 몇 군데. 벼룩 또는 초파리 표본 상용 x 선 현미경으로 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5입니다. 샘플 우리의 프로토콜 임베디드 마이크로-중부와 다시 몇 군데 수 같은 5 dpf zebrafish 유 충은 2011 (A)와 (B) 2013, 화살 보기의 평균 강도 계획으로 몇 군데. 이미지 스캔 후 저장 표시 해 부 특징의 보전 사이 비교. 두 검사에서 근육 클로즈업 (C) (D) 강도 프로 파일 생성을 위해 사용 하는 해당 영역을 나타내는 세그먼트 라인으로 제공 됩니다. 두 라인을 따라 그들의 해당 평균으로 정규화 강도 프로필 공간 일치 하는 두 검사에서 로컬 봉우리 보여줍니다. (E) 평균 A에 선택된 영역에 대 한 강도 값 및 B 신경 핵 (N, 녹색) 배경 (Bg, 자주색)에 속하는, 백색 질 (W, 블루), 근육 (M, 오렌지) 배경 (흰색)에 대 한 평균으로 나눈 그리고 신호 대 잡음을 생성 하는 데 사용 비율 (SNR), 검사 사이 잘 대응 한다. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 원고에서 선물이 고정 및 스테인드 밀리미터 규모의 엄밀한 동원 정지에 대 한 자세한 프로토콜 마이크로 CT 영상에 대 한 (0.5 ~ 2.5 m m 직경) 견본. 해상도 및 속도 마이크로 CT 기술의 급속 한 진보를 감안할 때, 다시 이미징 기능으로 영구 샘플 보존 방법 매우 바람직합니다. 전통적으로, 밀도 포함 수 지 ultrathin 섹션을 잘라내어 표본에 손상을 최소화 구조 지원을 제공 하기 위해 전자 현미경에 사용 일반적으로 됩니다. 우리의 방법은 비파괴 이미징 동안 경직 된 동원 정지에 대 한 사용을 적응. 과잉 수 지의 존재에서 이미징 아티팩트를 최소화 하기 위해 우리는 x 선 투명 폴 리 이미 드 튜브 가장자리 없이 라운드 샘플을 만들 하 고 샘플 주위 수 지의 볼륨을 제한의 사용을 실행 했다.

내장 프로시저의 최적의 결과 몇 가지 중요 한 단계와 절차를 통해 샘플 무결성에 대 한 관심의 주의 실행 조건. 실제로, 표본 손상 손상 된 최종 이미지 이미징의 실행의 성공에 발생 합니다. 고통 응답의 감소에 기여 놀 아 요 떼어낸된 조직 더 높은 온도에서 더 급속 하 게 저하 하는 때문에, 우리는 미리 냉장된 시 약을 사용 합니다. 큰 표본 간, 췌 장, 창 자 등 내장은 완전히 고정 되도록 표본 내부로 정착 액의 항목을 허용 하도록 잘릴 필요가 있습니다. 떼어낸된 조직 악화 및 생물학 구조를 파괴 하는 구조적 무결성을 잃고. 또 다른 키 단계는 자연 정렬에 견본을 유지 하는 것입니다. 따라서, 우리는 우리가 사용 절차와 고정 하는 동안 특히 중요 플랫 컨테이너의 사용에 대 한 옹호. 폴 리 프로필 렌에서 고정 튜브 또는 원뿔 튜브는 일반적으로 V 모양의 바닥을 피해 야 한다 그들은 구 부, 길쭉한 샘플을 일으킬 수 있기 때문에 하는 시료의 자연 형태를 왜곡. 또한,이 수 지의 사용을 최소화 하기 위해 폴 리 이미 드 튜브 내경 표본의 폭 보다 약간 더 큰만입니다. 시료의 절곡 수 있습니다 또한 손상 될 표본에 튜브가. 그것은 또한 손상 사지를 피하기 위해 자연 앞으로 방식으로 표본 튜브에 전송 것이 좋습니다. 적절 한 탈수는 또 다른 중요 한 단계입니다. 이것은 천천히 바꿉니다 물 EtOH,이 더 많은 수 지와 혼합할 수 있는 EtOH 농도 증가의 작은 단위로 수행 됩니다. EtOH 농도 있는 큰 증가 조직 수축에 연관 되며 이어지도록 더 점진적 EtOH 외피의 추가 단위로 ameliorated 수 있습니다. 마지막으로, 있을 경우 견본 또는 공기 주머니의 움직임을 최소화 하는 샘플 배치 됩니다 가로 수 지 중 합 (하루 4 월말) 동안. 공기 주머니 또는 실 란 트 표본 옆 가장자리 회절, 이미지 품질와 관련 된 x-선 영상과 광학 아티팩트를 발생 합니다.

프로토콜, 다른 포함 수 지 및 금속에 대 한 가능한 수정에 관하여 얼룩 각각 LR 화이트 아크릴과 학부모, 대신 사용할 수 있습니다. Embed812, 전자 현미경 검사 법에서 일반적으로 사용 되는 에폭시 수 지 높은 점성, 더 어려운 전송, 표본의 왜곡을 일으킬 수 있습니다 이며 아크릴 또는 글리콜 메타 크 릴 산 수 지 보다 더 높은 배경와 연결. 동안 JB4 플러스, 글리콜 메타 크 릴 산, EMbed812 보다 적게 점성 이다과 낮은 배경, 공기 주머니의 무작위로 형성 표본 주변 자주 나타납니다. 앞에서 언급 했 듯이, 공기 주머니는 이미지 품질을 저하 하 고 특히 귀중 한 샘플에 대 한 문제가 있다. 그것을 Technovit 7100, 다른 글리콜 메타 크 릴 산, 방해 학부모 얼룩, 최종 이미지에 가난한 대조 결과 지적 가치가 있다. 비교적, LR 화이트 아크릴 물 처럼 점성, 낮은 배경 있으며 학부모 얼룩과 방해 하지 않는다. 우리 손에 샘플 손상 또는 공기 거품 없이 LR 화이트에 포함의 성공률은 95% 이상. 이러한 이유로, 우리 조직 마이크로-중부 대 포함 수 지로 그것의 사용을 옹호 얼룩에 관하여 다양 한 금속 결과 오스뮴 tetroxide, 요오드, 등 얼룩과 마이크로-CT 영상에서 학부모 비교 하 고 다른 곳에서 논의15,,1617 되었으며 이것의 범위를 벗어납니다. 원고입니다.

샘플 크기는 우리의 현재 프로토콜을 주요 한계입니다. 흡입 튜브에 표본 전송을 채용 하 고, 이후는 견본을 볼 수 있는 능력은 방향과 그것이 정말로 튜브에서 수 있도록 중요 합니다. 결과적으로, 하위 밀리미터 Tardigrade 같은 샘플링 (즉., 물 곰) 포함 수를 현미경 사용을 필요로 하기 때문에 매우 어렵다. 흡입을 적용 현미경 표본 초점면에서 쉽게 손실 됩니다 그리고 만약 그들이 통과 너무 멀리 튜브의 연결된 끝을 결정 하 고 어려운 재발견, 도전 될. 마우스 배아, (3-10 m m)와 같은 더 큰 견본 포함 프로토콜 (그림 4D)에 약간의 수정을 포함 될 수 있습니다. 특히, 폴 리 이미 드 튜브 1/3 포함 이전 생산 된 액체 수 지로 채워졌다. 고정 및 스테인드 샘플 미리 polymerized 수 지 위에 배치 했다. 튜브는 완전히 취소 polymerized 수 지로 가득 그리고 뒤에 두 번째 합.

우리의 포함 프로토콜의 중요성은 매니폴드. Rigidly 고정된 전체 조직 또는 동물 표본 등의 이유로 바람직하지는: (1) 생성 또는 준비; 하기 어려운 샘플의 장기 저장소 만들기 (2) 다시 인수 데이터; (3) 수 있도록 직렬 이미징 사용 하 여 여러 이미지 형식; 그리고 교정 및 기술 개발에 대 한 (4) 제공 기준. 샘플 포함 우리의 절차와 준비는 손상에 대해 탄력적 고체 수 지에 쌌 다 고 따라서 쉽게 저장할 수 아마도 무기한. 장기 저장은 발형체 프로젝트와 관련 된 그들과 같은 희귀 또는 일일이 생성 된 표본에 대 한 특히 유용 합니다. 또한, 디지털 데이터 손실 되는 데이터는 원래 샘플에서 생성할 수 있습니다. 잠재적으로 긴 기간 동안 다시 이미징의 기능 더 고급 이미징 형식 미래에 함께 심문을 동일한 샘플 수 있습니다. 샘플 이미지 인스턴스 간에 물리적으로 안정 이기 때문에, 이미지 등록 이전 및 이후 데이터 세트 사이 촉진 동일한 방향으로 동일한 견본에서 획득 됩니다. 예를 들어 저해상도 이미지 zebrafish 애벌레에 조직의 세분화를 수만 있습니다. 같은 유 충 수 나중 될 다시 몇 군데 더 높은 해상도에서 자세한 셀룰러 해상도 전산 분석 하. 등록된 검색 사이 직접적인 비교를 위해이 기능은 마이크로-중부의 기술 개발을 위한 표준 잠재력으로 수 지에 포함 된 샘플 제안 이미징 방법에 어떠한 변경의 효과 샘플 준비 단계에서 모든 변수 제어 됩니다 있도록 동일한 샘플의 이미징에 의해 평가 될 수 있다. 마지막으로, 수 지에 포함 된 표준 샘플 이미지의 일관성을 위해 테스트 계기 캘리브레이션에 사용할 수 있습니다.

돌연변이 병에 걸린 물고기 조직학 검사 이전 작업이 보여주었다 셀룰러 해상도 감지 해 현미경36또는 저전력을 사용 하 여 총 검사에서 간과 되는 조직 구조에서 미묘한 이상 수 스테레오 한 현미경 우리 인간의 샘플을 우리의 고해상도 분석을 확장 하고자 합니다. Zebrafish 애벌레, 우리의 개발 작업의 기본 주제를 구성 하는 인간의 바늘 생 검에 그들의 취약성, 세포와 세포 조직이, 크기 (1-3 m m 직경), 길쭉한 모양와 비슷합니다. Zebrafish와 다른 작품 이기는 하지만 낮은 해상도37에 그 마이크로-CT는 성공적으로 얼룩이 지 고 인간의 조직, 스캔을 보여주는 우리의 광범위 한 경험을 바탕으로, 우리 우리의 접근 이미징 및 바늘 biopsies의 분석에 부가 가치를가지고 기대 합니다. 우리는 견적 했다 30 달러 미만 잠재적으로 수 같은 조건의 최대 20 샘플의 한 준비에 대 한 충분 한 키트의 조립. 우리의 포함 방법에 의해 준비 하는 샘플은 물리적 손상 저항 하 고 그러므로 수송 하 게 쉬운. 낮은 비용 및 수송의 용이성 제안에서 샘플의 수집의 가능성, 전세계 특히 분야는 마이크로 CT와 셀룰러 해상도 이미지를 쉽게 액세스할 수 있습니다. 우리의 비전은 디지털 아틀라스 인간의 조직의 창조를 활성화 하 고 동시에 수를 수정 하 고 대 한 현재 분석 파이프라인 강화 연구원 바늘 생 검 (0.1에서 몇 테라 바이트에 배열 되는)의 높은 해상도 디지털 파일입니다. 지역화 그리고 풀 3D의 컨텍스트 내에서 검색 하는 조직 세포와 조직 구조의 양적 특성.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 롤랜드 마이어스 원래 가장 프로토콜을 제공 하는 친절 하 게 감사 하 고 싶습니다. 또한, 닥터 존 Colbourne 벼룩 견본을 제공 하기 위한, 초파리 견본을 제공 하기 위한 박사 Santhosh Girirajan 박사 Fadia 카 마우스 배아를 제공 하기 위한 감사 드립니다. 조사자는 NIH에서 지원 자금 인정 (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), 암 연구, 그리고 생명 과학의 PSU 헉 학회 및 CyberScience에 대 한 연구소에서 파일럿 상 자금에서 제이크 Gittlen 실험실.

Materials

10X Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4
Phosphotunstic Acid VWR MK282402
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical MS-222
LR White Electron Microscopy Sciences 14380
Polyimide tubing (ID 0.04") Nordson Medical 141-0065 The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request.
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200
Oil-based soft modeling clay Sculpey S302 001
Micropipette P200 Gilson F123601
Micropipette P1000 Gilson F123502
Glass vials VWR 66015-042
V-shaped basin VWR 89094-676
Weigh boats VWR 10803-148
200 μL yellow micropipette tip Fisher Scientific 02-707-500
1 mL blue micropipette tip Fisher Scientific 02-681-163
Tabletop shaker Thermolyne M71735
Camera Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD
X-ray microscope Zeiss Xradia 520 Versa
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Lin, A. Y., Ding, Y., Vanselow, D. J., Katz, S. R., Yakovlev, M. A., Clark, D. P., Mandrell, D., Copper, J. E., van Rossum, D. B., Cheng, K. C. Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58293, doi:10.3791/58293 (2018).
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