식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정
Summary
여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.
Abstract
그것은 구조 및 생화학 연구 재조합 분 비 진 핵 단백질을 표현 하는 과학자에 대 한 도전이 되었습니다. 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 일부 포스트 번역 상 수정 재조합 진 핵 세포 분 비 단백질을 표현 하는 데 사용 하는 시스템 중 하나입니다. 분 비 단백질 단백질 glycosylation, 이황화 결합 형성, 및 다른 포스트 번역 상 수정 분 비 경로 통해 라우팅할 필요가 있다. 를 개선 하기 위해 분 비 식물 단백질의 기존 곤충 세포 표현 잠재 식 벡터 중 하나는 GP67의 추가 또는 발기인 및 다중 복제 사이트 간에 hemolin 신호 펩 티 드 순서에 의해 수정 됩니다. 이 새롭게 설계 된 수정된 벡터 시스템은 성공적으로 애기 thaliana의 수용 성 재조합 분 비 식물 수용 체 단백질의 높은 수익률을 생산. 두 애기 TDR 및 PRK3 원형질 막 수용 체의 세포 외 도메인 표현된 식물 단백질의 x 선 결정학 연구 화 시키는 했다. 수정 된 벡터 시스템 뿐만 아니라 동물의 왕국에 있는 재조합 형 분 비 단백질의 표정을 위해 잠재적으로 이용 될 수 있는 향상 된 도구입니다.
Introduction
특히 x 선 결정학 연구에 대 한 생화학 및 생물 characterizations 위해 균질 재조합 단백질의 대량 생산의 수 연구 실험실을 위한 필수적입니다. 대장균, 효 모, 곤충 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 등 그들의 사이에서 많은 확고 분리 식 시스템, 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템은 가장 중 일반적으로 구조적으로 접힌된 대형 재조합 진 핵 단백질의 단백질 결정 화1대량 생산 기법을 사용.
잠재 식 시스템의 식 벡터는 강한 polyhedrin 또는 재조합 세포내 단백질2,3의 높은 수익률을 생산 하는 P10 발기인을 포함 하도록 설계 되었습니다. 재조합 잠재 수 있도록, 관심사의 유전자 Autographa californica nucleopolyhedroviral 멀티 게놈의 polyhedrin (polh) 로커 스를 포함 하는 곤충 벡터에 복제 됩니다. 결과 구문 다음 시퀀스 및 올바른 열려있는 독서 프레임 (ORF) 확인. 올바른 구문 다음 transfection의 과정을 통해 호스트 곤충 세포에 도입 되었습니다. 관심사의 유전자는 상 동 재조합에 의해 바이러스 성 게놈에 삽입 됩니다. 이 이벤트는 재조합 생산 하는 후 복제 바이러스 입자1언약궤 재조합 형 바이러스 성 게놈의 생산에서 발생 합니다.
곤충 세포 표현 시스템에서 가장 일반적으로 사용 되는 Sf9 및 높은 5 (Hi5) 세포 이다. Sf9 세포는 Sf21, Spodoptera frugiperda의 번데기 난소 세포에서 파생 된의 클론 분리 되며 Hi5 세포 클론 분리는 부모의 Trichoplusia ni 난소 세포 선 테네시-3684,5에서 파생 된. Hi5 셀 일반적으로 재조합 단백질6의 더 높은 양을 생성을 선택 하는 동안 공동 transfections, 바이러스 증폭 및 상 패 분석 실험, Sf9 세포에 지휘 된다. Hi5 세포는 돌연변이 바이러스를 생산 하는 그들의 추세 때문에 세대 및 바이러스 progenies의 증폭에 적합 하지 않습니다 지적 가치가 있다. 전통적으로, 25-30 ° C의 온도 범위는 곤충 세포의 경작에 좋은 것으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 27-28 ° C 곤충 세포 성장과 감염7,8에 대 한 최적의 온도 보고 되었습니다.
강한 신호 순서 선행 하는 유전자의 소개 secreted 단백질의 높은 식이 필요 합니다. 신호 순서 효율적으로 단백질 분 비와 포스트 번역 상 수정 적절 한 접는 및 안정화3에 필요한에 대 한 바인딩과 그물에 번역 된 재조합 단백질을 안내 것입니다. 신호 펩 티 드 순서는 잠재 봉투 단백질 GP64/67, 꿀벌 melittin, 그리고 다른 사람, 같이 잠재 중재 식 시스템3분 비 재조합 형 단백질의 표정을 촉진 하기 위해 선택 되었습니다. GP67의 신호 펩 티 드의 도입 대상 유전자9의 내장 신호 펩 티 드를 사용 하 여 비교 secreted 재조합 단백질의 식 수율을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. Hemolin는 거 대 한 실크 나 방 Hyalophora cecropia, 박테리아 감염10시 유도의 hemolymph 단백질 이다. 유도 식의 상대적으로 높은 수준으로 인해 유전자의 신호 펩 티 드 순서 잠재 곤충 세포 시스템에서 재조합 단백질의 분 비 식 중재에 사용할 수 있습니다.
A. thaliana Tracheary 요소 차별화 금지 요인 수용 체 (TDR)와 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 둘 다 단백질11,12의 식물 신 부유한 반복 같은 수용 체 키 니 아 제 (LRR-RLK) 가족에 속하는 . 구조와 공장 수용 체 단백질의, 뿐만 아니라 다른 식물 분 비 단백질의 구조 및 생 화 확 적인 특성 있을이 가족의 기능을 공부 하기 위하여 잠재 곤충 세포 표현 시스템 수정 되었습니다. 단백질의 품질 및 생산 수율을 향상 시킵니다. TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인 성공적으로 두 개의 수정된 식 벡터를 사용 하 여 잠재 곤충 세포 표현 시스템에서 표현 되었습니다. TDR 및 PRK3 단백질의 extracellular 도메인 모두 화 시키는 되는. 이 문서는 GP67 또는 발기인 및 여러 복제 사이 hemolin 신호 순서를 통합 하 여 표현과 많은 양의 두 수정된 잠재 식 벡터와 재조합 분 비 식물 단백질의 정화를 보고 사이트입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
크기 및 생물 학적 시스템에 단백질의 수천의 안정성에 다양성을 감안할 때, 그것은 종종 경험적 연구에 대 한 실험실을 분리 표현 시스템을 결정 하는 특정 단백질의 표현에 대 한 선택. 대장균 식 시스템은 종종19최대 규모 박테리아, 문화 미디어, 그리고 상대적으로 완화의 저렴 한 비용의 짧은 라이프 사이클에 따른 단백질 표정에 대 한 첫 번째 선택. 그러나 60 kDa,, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 Guozhou Xu에 대 한 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 새로운 교수 시작 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
References
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
